Pluripotentsed nahkhiirte tüvirakud uute viiruste uurimise mudelina

Pluripotentsed nahkhiirte tüvirakud uute viiruste uurimise mudelina

Nahkhiired on arenenud ainulaadsete omadustega, nagu kõri kajalokatsioon ja lend, mõned neist on võimelised taluma selliseid viiruseid nagu raske ägeda respiratoorse sündroomi koronaviirused (SARS-CoV), Lähis-Ida respiratoorse sündroomi CoV (MERS-CoV) ning Marburgi ja Nipah viirused. Tugevate rakupõhiste nahkhiirte mudelite väljatöötamine võib aidata paremini mõista nahkhiirte viiruse juhtimist ja nende bioloogiat.

Hiljuti avaldatud selleteemalises uuringus bioRxiv * Eeltrükkimise server: teadlased genereerisid Rhinolophus ferrumequinum nahkhiirtest indutseeritud pluripotentsed tüvirakud (iPSC-d), kasutades modifitseeritud Yamanaka protokolli, et luua nahkhiired uudse in vivo mudeluuringuliigina.

Uuring: Nahkhiirte pluripotentsed tüvirakud näitavad ainulaadset peremees-viiruse vastastikust seost.Foto krediit: Jezper / Shutterstock.com

See uudisartikkel oli ülevaade esialgsest teaduslikust aruandest, mida avaldamise ajal ei olnud eelretsenseeritud. Alates selle esialgsest avaldamisest on teaduslikku aruannet nüüdseks eelretsenseeritud ja aktsepteeritud akadeemilises ajakirjas avaldamiseks. Lingid esialgsetele ja eelretsenseeritud aruannetele leiate selle artikli lõpus olevast jaotisest Allikad. Vaata allikaid

Uuringu kohta

Käesolevas uuringus uurivad teadlased, kas nahkhiired võiksid viiruse tootmiseks sobida.

Yamanaka ümberprogrammeerimise lähenemisviisi kasutati ümberprogrammeerimistegurite põhjal, nagu soo määrav piirkonna Y-box-2 geen, oktameeriga seonduv transkriptsioonifaktor 4 (Oct4), cMyc ja Kruppelilaadne tegur 4 (Klf4).

Nahkhiire embrüonaalsed fibroblasti (BEF) rakud eraldati R. ferrumequinum'ist, kusjuures ümberprogrammeerimisfaktorite taset muudeti, et aktiveerida ja blokeerida mitu signaaliülekande rada. Lisaks viidi läbi ka immunovärvimise ja ribonukleiinhappe (RNA) sekveneerimise (RNA-seq) analüüsid.

Pluripotentsete nahkhiirte tüvirakkude saamine. (A) Pluripotentsete nahkhiirte tüvirakkude saamise strateegia illustratsioon. BEF, embrüonaalsed fibroblastid; OSMK, Oct4, Sox2, cMyc, Klf4; FB, fibroblasti sööde; PSC, pluripotentse tüviraku sööde; PSC+, PSC lisanditega. (B) Hiire embrüonaalsetel fibroblastidel kasvatatud väljakujunenud BiPS-rakukolooniate morfoloogia. (C) Oct4 immunofluorestsentsi tuvastamine BiPS-rakkudes. (D) RNA-seq andmete MA graafik, mis illustreerib transkriptsioonilisi erinevusi nahkhiirte embrüonaalsete fibroblastide (BEF) ja pluripotentsete tüvirakkude (BiPS) vahel. Esile tõstetakse valitud geenid, millel on teadaolevad funktsioonid pluripotentsuse loomisel või säilitamisel. (E) BEF- või BiPS-rakkudest saadud ATAC-seq signaalide Kmean klastri analüüs. C, klastrid. (F), BEF- ja BiPS-rakkudest saadud RRBS-i tulemuste tihedusgraafik. PCC, Pearsoni korrelatsioonikordaja. (G) Histooni 3 metüülimise oleku hajuvusdiagrammid K4 (aktiveeriv kromatiini modifikatsioon) või K27 (repressiivne kromatiini modifikatsioon) pärast ChIP-seq BEF- või BiPS-rakkudest, nagu näidatud. (H) H3K4me3 ja H3K27me3 hajuvusdiagramm BiPS rakkudes, mis illustreerib kahevalentsete kromatiini saitide olemasolu BiPS rakkudes. (I) Valitud geenide RNA-seq, ATAC-seq ja H3K4me3 või H3K27me3 ChIP-seq signaalid, millel on teadaolev roll ümberprogrammeerimisel ja mis on aktiveeritud (Nanog, Kit) või represseeritud (Thy1) BiPS-is võrreldes BEF-rakkudega.

Modifitseeritud ümberprogrammeerimismeetodi mõju nahkhiirte epigeneetilistele molekulidele ja kromatiinile hinnati transposaasile ligipääsetava sekveneerimisega kromatiini (ATAC-seq) abil. Samuti viidi läbi desoksüribonukleiinhappe (DNA) metüloomi kaardistamise analüüsid ning kromatiini immunosadestamise ja sekveneerimise (ChIP-seq) analüüsid. Protokollid optimeeriti, et võimaldada nahkhiirte SC diferentseerumist kolmeks idukihiks, samas kui pluripotentsuse hindamiseks viidi läbi embrüoidkeha (EB) diferentseerumisanalüüs.

Seejärel süstiti nahkhiirte iPSC-d (BiPSC-d) immuunsupresseeritud hiirtele ja BiPSC-dest loodi embrüonaalsed struktuurid. Uuringuprotokoll valideeriti BiPS-rakkude arendamisega evolutsiooniliselt kaugel asuvast nahkhiirest Myotis myotis.

Võrdlev transkriptsiooniline geeniprofiil ja põhikomponentide analüüsid (PCA) viidi läbi nahkhiirte liikide Rhinolophus ja filogeneetiliselt mitmekesiste hiirte, inimeste, koerte, sigade ja marmosettide puhul.

Geeni ontoloogia analüüs viidi läbi, et hinnata kaasaegset geenirikastust konkreetsete bioloogiliste radade jaoks. Uudsed torujuhtmed on välja töötatud tüvirakkude ribonukleiinhappe (RNA) sekveneeritud (RNA-seq) andmete metagenoomilise klassifikatsiooni, de novo oletatava retroviiruse kontigeerimise ja genoomse kaardistamise põhjal, et tuvastada heauskseid retroviiruse lugemisi. Lisaks uuriti RNA viirustega seotud antigeenimarkereid.

Uuringu tulemused

Spetsiifiline ümberprogrammeerimisfaktori suhe, samuti fibroblastide kasvufaktori-2 (Fgf-2), tüvirakufaktori (Scf), leukeemiat inhibeeriva faktori (Lif) ja forskoliini lisamine söötmele võimaldas pidurdamata BiPSC kasvu, homogeensete ja tihedate nahkhiirte kolooniate ilmumist 14–16 päeva jooksul.

BiPSC-d väljendasid Oct4 pluripotentsustegurit proliferatsioonikiirusel, mis oli identne inimese PSC-de proliferatsioonikiirusega. Enamik rakke sisaldas 56 kromosoomi ja replitseeriti ilma eksogeensete ümberprogrammeerimisfaktorite ja morfoloogiliste muutusteta.

BiPSC-d diferentseerusid kolmeks idukihiks ja moodustasid seejärel EB-d ja organoidid. RNA-seq analüüs näitas kanooniliste pluripotentsusega seotud geenide, nagu SRY-2, Nanog ja Oct4, indutseeritud endogeenset ekspressiooni.

Kuid geneetiline profiil ei olnud täielikult kooskõlas pluripotentsuse olekuga. Selle asemel ekspresseeriti naiivseid pluripotentseid olekutegureid, nagu Klf4 ja 17, östrogeeniga seotud retseptori beetavalku (Essrb), transkriptsioonifaktorit E3 (Tfe3) ja transkriptsioonifaktorit CP2 Like 1 (Tfcp2l1). Täheldati koosekspresseeritud Tfcp2l1/tsink-sõrmevalku (Zic2) ja Orthodenticle Homeobox 2 (Otx2)/Tfe3, samuti praimitud/naiivseid tegureid.

Kromatiini konfiguratsiooni ja CpG 191 metüülimise muutusi täheldati kogu nahkhiire genoomis. ChiP-seq tulemused näitasid inimese ja nahkhiirte bivalentsusgeenide kattumist, kuigi mõned geenid olid liigispetsiifilised.

BiPSC-d programmeeriti transkriptsiooniliselt ja epigeneetiliselt ümber. BIPSC-d olid positiivsed ektodermi, mesodermi ja endodermi paariskarbvalgu (Pax6), 213T ja alfa-fetoproteiini (AFP) markerite suhtes.

ERAS-i geen oli allareguleeritud, samas kui hüaluronidaaside ja ADP-ribosüülimisfaktorite (ARF) geenid olid rühmade vahel eristamatud. Rhinolophuse blastoidid näitasid embrüonaalseid struktuure, mis olid seotud lamestatud trofoblastse epiteeli väljakasvu ja sisemise rakumassi laienemisega. Myotise nahkhiirte tulemused näitasid, et uuringuprotokolli saab rakendada erinevate nahkhiireliikide puhul.

PCA analüüs näitas selget nahkhiirte tüvirakkude rühma. Kuid ainult kaheksa tippgeeni näitasid olulist positiivset selektsiooni R. ferrumequinum'is, kusjuures enamik geene kuulus ootamatutesse kategooriatesse. Lisaks oli CoV haigus Kyoto geenide ja genoomide entsüklopeedia (KEGG) kõige olulisem kategooria.

BiPSC-des tuvastati kollageeni tüüpi III alfa 1 (Col3a1) ja mutsiini 1 (Muc1) geenid, mis viitavad nahkhiire-spetsiifilistele geneetilistele kohandustele. Ümberprogrammeerimine paljastas endogeensed retroviiruse (ERV) järjestused.

BiPSC-d sisaldasid mitut viirusega seotud endogeniseeritud järjestust, mille piirkonnad olid homoloogsed inimese herpesviiruse 4, inimese respiratoorse süntsütiaalviiruse ja SARS-CoV-2 isolaadiga. R. ferrumequinum'i genoomsed järjestused olid sarnased inimese CoV 229E ja inimese CoV OC43 järjestustega.

Tuvastati mitu retroviiruse integratsioonisaiti, mis olid homoloogsed selliste viirustega nagu Mason-Pfizer ahviviirus, koalaviirus ja Jaagsiekte lamba retroviirus. Genoom oli homoloogne volepoksi, tuulerõugete, oravrõugete, ahvirõugete ja valgerõugete sündroomi viirustega.

Järeldused

BiPSC järjestused olid sarnased viiruse genoomi järjestustega. Seega saab nahkhiirte transkriptsiooniliselt lubavat pluripotentsuse seisundit kasutada nahkhiirte füsioloogiaga seotud uudsete nahkhiirte viiruse järjestuste ja nende viiruse hostimisvõime avastamiseks.

See uudisartikkel oli ülevaade esialgsest teaduslikust aruandest, mida avaldamise ajal ei olnud eelretsenseeritud. Alates selle esialgsest avaldamisest on teaduslikku aruannet nüüdseks eelretsenseeritud ja aktsepteeritud akadeemilises ajakirjas avaldamiseks. Lingid esialgsetele ja eelretsenseeritud aruannetele leiate selle artikli lõpus olevast jaotisest Allikad. Vaata allikaid

Viited:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Dejosez, M., Marin, A., Hughes, GM, et al. (2022). Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren einzigartige Verflechtung zwischen Wirt und Viren. bioRxiv. doi:10.1101/2022.09.23.509261. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.23.509261v1.
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Déjosez, Marion, Arturo Marin, Graham M. Hughes, Ariadna E. Morales, Carlos Godoy-Parejo, Jonathan L. Gray, Yiren Qin, et al. 2023. „Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren ungewöhnliche Verflechtung zwischen Wirt und Viren.“ Zelle 186 (5): 957-974.e28. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.01.011. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867423000417.

Artiklite redaktsioonid

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.