Pluripotentit lepakon kantasolut mallina uusien virusten tutkimiseen

Pluripotentit lepakon kantasolut mallina uusien virusten tutkimiseen

Lepakoille on kehittynyt ainutlaatuisia ominaisuuksia, kuten kurkunpään kaikuja ja lentoa, ja jotkut pystyvät sietämään viruksia, kuten vakavia akuutin hengitystieoireyhtymän koronaviruksia (SARS-CoV), Lähi-idän hengitystieoireyhtymän CoV-viruksia (MERS-CoV) sekä Marburg- ja Nipah-viruksia. Vankkaiden solupohjaisten lepakkomallien kehittäminen voisi johtaa parempaan ymmärrykseen lepakkovirusten hallinnasta ja niiden biologiasta.

Äskettäin julkaistussa tutkimuksessa aiheesta bioRxiv * Preprint-palvelin: Tutkijat loivat indusoituja pluripotentteja kantasoluja (iPSC:itä) Rhinolophus ferrumequinum -lepakoista käyttämällä modifioitua Yamanaka-protokollaa vahvistaakseen lepakot uudeksi in vivo -mallitutkimuslajiksi.

Tutkimus: Lepakon pluripotentit kantasolut paljastavat ainutlaatuisen isännän ja virusten välisen yhteyden.Valokuva: Jezper / Shutterstock.com

Tämä uutisartikkeli oli katsaus alustavaan tieteelliseen raporttiin, jota ei ollut vertaisarvioitu julkaisuhetkellä. Alkuperäisen julkaisunsa jälkeen tieteellinen raportti on nyt vertaisarvioitu ja hyväksytty julkaistavaksi akateemisessa lehdessä. Linkit alustaviin ja vertaisarvioituihin raportteihin löytyvät tämän artikkelin lopun Lähteet-osiosta. Näytä lähteet

Tietoja tutkimuksesta

Tässä tutkimuksessa tutkijat selvittävät, voisivatko lepakot soveltua virustuotantoon.

Yamanaka-uudelleenohjelmointimenetelmää käytettiin uudelleenohjelmointitekijöiden, kuten sukupuolen määräävän alueen Y-box-2-geenin, oktameeria sitovan transkriptiotekijän 4 (Oct4), cMycin ja Kruppel-kaltaisen tekijän 4 (Klf4) perusteella.

Lepakon alkion fibroblastisolut (BEF) eristettiin R. ferrumequinumista siten, että uudelleenohjelmointitekijöiden tasoja muutettiin useiden signalointireittien aktivoimiseksi ja estämiseksi. Lisäksi suoritettiin myös immunovärjäys- ja ribonukleiinihappo (RNA) sekvensointi (RNA-seq) analyysit.

Pluripotenttien lepakon kantasolujen hankkiminen. (A) Esimerkki strategiasta lepakon pluripotenttien kantasolujen saamiseksi. BEF, alkion fibroblastit; OSMK, Oct4, Sox2, cMyc, Klf4; FB, fibroblastiväliaine; PSC, pluripotentti kantasoluelatusaine; PSC+, PSC lisäaineilla. (B) Hiiren alkion fibroblasteissa kasvatettujen vakiintuneiden BiPS-solupesäkkeiden morfologia. (C) Oct4:n immunofluoresenssidetektio BiPS-soluissa. (D) RNA-seq-tietojen MA-diagrammi, joka kuvaa transkriptionaalisia eroja lepakon alkion fibroblastien (BEF) ja pluripotenttien kantasolujen (BiPS) välillä. Valitut geenit, joilla on tunnettuja toimintoja pluripotenssin luomisessa tai ylläpitämisessä, on korostettu. (E) BEF- tai BiPS-soluista saatujen ATAC-seq-signaalien Kmean-klusterianalyysi. C, klusterit. (F), BEF- ja BiPS-soluista saatujen RRBS-tulosten tiheyskäyrä. PCC, Pearson-korrelaatiokerroin. (G) Histoni 3:n metylaatiostatuksen sirontadiagrammit kohdassa K4 (aktivoiva kromatiinimodifikaatio) tai K27 (repressiivinen kromatiinimodifikaatio) ChIP-sekvenssin jälkeen BEF- tai BiPS-soluista, kuten osoitettu. (H) H3K4me3:n ja H3K27me3:n sirontadiagrammi BiPS-soluissa havainnollistaen kaksiarvoisten kromatiinikohtien läsnäoloa BiPS-soluissa. (I) Valittujen geenien RNA-seq, ATAC-seq ja H3K4me3 tai H3K27me3 ChIP-seq signaalit, joilla on tunnetut roolit uudelleenohjelmointissa ja jotka aktivoituvat (Nanog, Kit) tai repressoidaan (Thy1) BiPS:ssä BEF-soluihin verrattuna.

Modifioidun uudelleenohjelmointimenetelmän vaikutukset lepakoiden epigeneettisiin molekyyleihin ja kromatiiniin arvioitiin käyttämällä transposaasin käytettävissä olevaa kromatiinia sekvensoinnilla (ATAC-seq). Suoritettiin myös deoksiribonukleiinihapon (DNA) metylomikartoitusanalyysit ja kromatiini-immunosaostus- ja sekvensointianalyysit (ChIP-seq). Protokollat ​​optimoitiin mahdollistamaan lepakoiden SC-erilaistumisen kolmeen itukerrokseen, kun taas embryoid body (EB) -erilaistumismääritys suoritettiin pluripotenssin arvioimiseksi.

Lepakko-iPSC:t (BiPSC:t) injektoitiin sitten immunosuppressoituihin hiiriin ja BiPSC:istä luotiin alkiorakenteita. Tutkimusprotokolla validoitiin kehittämällä BiPS-soluja evoluutionaalisesti etäisestä Myotis myotis -lepakkasta.

Vertaileva transkriptionaalinen geeniprofilointi ja pääkomponenttianalyysit (PCA) suoritettiin lepakalajeilla Rhinolophus ja fylogeneettisesti monimuotoisilla nisäkäslajilla hiirillä, ihmisillä, koirilla, sioilla ja marmosetteilla.

Geeniontologia-analyysi suoritettiin arvioidakseen uusinta geenirikastumista tiettyjen biologisten reittien osalta. Uusia putkistoja on kehitetty perustuen kantasolujen ribonukleiinihappo (RNA) sekvensoitujen (RNA-seq) tietojen metagenomiseen luokitukseen, de novo oletettuun retroviruksen jatkuvuuskokoonpanoon ja genomikartoitukseen bona fide retroviruslukemien tunnistamiseksi. Lisäksi tutkittiin RNA-viruksiin liittyviä antigeenimarkkereita.

Tutkimustulokset

Erityinen uudelleenohjelmointitekijäsuhde sekä fibroblastien kasvutekijä-2:n (Fgf-2), kantasolutekijän (Scf), leukemiaa estävän tekijän (Lif) ja forskoliinin lisääminen viljelyalustaan ​​mahdollistivat estämättömän BiPSC-kasvun, jolloin homogeeniset ja tiheät lepakkopesäkkeet ilmestyivät 14–16 päivässä.

BiPSC:t ilmensivät Oct4-pluripotenssitekijää proliferaationopeudella, joka oli identtinen ihmisen PSC:iden lisääntymisnopeuden kanssa. Useimmat solut sisälsivät 56 kromosomia ja replikoituivat ilman eksogeenisiä uudelleenohjelmointitekijöitä ja morfologisia muutoksia.

BiPSC:t erilaistuivat kolmeen itukerrokseen ja muodostivat myöhemmin EB:itä ja organoideja. RNA-seq-analyysi osoitti kanonisten pluripotenssiin liittyvien geenien, kuten SRY-2, Nanog ja Oct4, indusoituneen endogeenisen ilmentymisen.

Geneettinen profiili ei kuitenkaan ollut täysin yhdenmukainen pluripotenssitilan kanssa. Sen sijaan ekspressoitiin naiiveja pluripotentteja tilatekijöitä, kuten Klf4 ja 17, estrogeeniin liittyvä beetaproteiini (Essrb), transkriptiotekijä E3 (Tfe3) ja transkriptiotekijä CP2 Like 1 (Tfcp2l1). Havaittiin samanaikaisesti ekspressoitunutta Tfcp2l1/sinkkisormiproteiinia (Zic2) ja Orthodenticle Homeobox 2:ta (Otx2)/Tfe3:a sekä esivalmistettuja/naiiveja tekijöitä.

Muutoksia kromatiinikonfiguraatiossa ja CpG 191 -metylaatiossa havaittiin koko lepakon genomissa. ChiP-seq-tulokset osoittivat päällekkäisyyttä ihmisen ja lepakon bivalenssigeenien välillä, vaikka jotkut geenit olivat lajispesifisiä.

BiPSC:t ohjelmoitiin uudelleen transkriptionaalisesti ja epigeneettisesti. BIPSC:t olivat positiivisia ektodermin, mesodermin ja endodermin parillisen laatikkoproteiinin (Pax6), 213T:n ja alfafetoproteiinin (AFP) markkereille.

ERAS-geeniä säädeltiin alaspäin, kun taas hyaluronidaasien ja ADP-ribosylaatiotekijöiden (ARF:t) geenit eivät olleet erotettavissa ryhmien välillä. Rhinolophus-blastoidit osoittivat alkiorakenteita, jotka olivat sitoutuneet litistyneeseen trofoblastiseen epiteelin kasvuun ja sisäiseen solumassan laajenemiseen. Myotis-lepakkotulokset viittaavat siihen, että tutkimusprotokollaa voitaisiin soveltaa eri lepakkolajeihin.

PCA-analyysi paljasti erillisen ryhmän lepakon kantasoluja. Kuitenkin vain kahdeksan huippugeeniä osoitti merkittävää positiivista valintaa R. ferrumequinumissa, ja useimmat geenit kuuluivat odottamattomiin luokkiin. Lisäksi CoV-tauti oli merkittävimmin laajennettu luokka Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) -tietosanakirjassa.

Kollageenin tyypin III alfa 1 (Col3a1) ja mucin 1 (Muc1) geenit havaittiin BiPSC:istä, mikä viittaa lepakospesifisiin geneettisiin adaptaatioihin. Uudelleenohjelmointi paljasti endogeeniset retrovirussekvenssit (ERV).

BiPSC:t sisälsivät useita viruksiin liittyviä endogenisoituja sekvenssejä, joiden alueet olivat homologisia ihmisen herpesviruksen 4:lle, ihmisen hengitysteiden synsyyttivirukselle ja SARS-CoV-2-isolaatille. R. ferrumequinumin genomiset sekvenssit olivat samanlaisia ​​kuin ihmisen CoV 229E:n ja ihmisen CoV OC43:n.

Tunnistettiin useita retrovirusintegraatiokohtia, jotka olivat homologisia viruksille, kuten Mason-Pfizer-apinavirukselle, koalavirukselle ja Jaagsiekte lampaan retrovirukselle. Genomi oli homologinen volepox-, variola-, oravarokko-, apinarokko- ja valkorokkosyndroomaviruksille.

Johtopäätökset

BiPSC-sekvenssit olivat samanlaisia ​​kuin viruksen genomisekvenssit. Siten lepakoiden transkription sallivaa pluripotenssitilaa voitaisiin hyödyntää uusien lepakon fysiologiaan liittyvien lepakoiden virussekvenssejen ja niiden virusisännöintikykyjen löytämiseksi.

Tämä uutisartikkeli oli katsaus alustavaan tieteelliseen raporttiin, jota ei ollut vertaisarvioitu julkaisuhetkellä. Alkuperäisen julkaisunsa jälkeen tieteellinen raportti on nyt vertaisarvioitu ja hyväksytty julkaistavaksi akateemisessa lehdessä. Linkit alustaviin ja vertaisarvioituihin raportteihin löytyvät tämän artikkelin lopun Lähteet-osiosta. Näytä lähteet

Viitteet:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Dejosez, M., Marin, A., Hughes, GM, et al. (2022). Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren einzigartige Verflechtung zwischen Wirt und Viren. bioRxiv. doi:10.1101/2022.09.23.509261. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.23.509261v1.
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Déjosez, Marion, Arturo Marin, Graham M. Hughes, Ariadna E. Morales, Carlos Godoy-Parejo, Jonathan L. Gray, Yiren Qin, et al. 2023. „Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren ungewöhnliche Verflechtung zwischen Wirt und Viren.“ Zelle 186 (5): 957-974.e28. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.01.011. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867423000417.

Artikkelin tarkistukset

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.