Cellules souches pluripotentes de chauves-souris comme modèle pour étudier de nouveaux virus

Cellules souches pluripotentes de chauves-souris comme modèle pour étudier de nouveaux virus

Les chauves-souris ont évolué avec des caractéristiques uniques telles que l'écholocation laryngée et le vol, certaines étant capables de tolérer des virus tels que les coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV), les CoV du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV) et les virus de Marburg et Nipah. Le développement de modèles cellulaires robustes de chauves-souris pourrait conduire à une meilleure compréhension de la gestion des virus des chauves-souris et de leur biologie.

Dans une étude récemment publiée sur le sujet bioRxiv * Serveur de prépublication : les chercheurs ont généré des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à partir de chauves-souris Rhinolophus ferrumequinum en utilisant le protocole Yamanaka modifié pour établir les chauves-souris comme une nouvelle espèce d'étude modèle in vivo.

Étude: Les cellules souches pluripotentes de chauve-souris révèlent une interconnexion hôte-virus unique.Crédit photo : Jezper / Shutterstock.com

Cet article de presse était une revue d'un rapport scientifique préliminaire qui n'avait pas été évalué par des pairs au moment de la publication. Depuis sa publication initiale, le rapport scientifique a été évalué par des pairs et accepté pour publication dans une revue universitaire. Links to the preliminary and peer-reviewed reports can be found in the Sources section at the end of this article. Afficher les sources

À propos de l'étude

In der vorliegenden Studie untersuchen Forscher, ob Fledermäuse für die Virusproduktion geeignet sein könnten.

L’approche de reprogrammation Yamanaka a été utilisée sur la base de facteurs de reprogrammation tels que le gène Y-box-2 de la région déterminant le sexe, le facteur de transcription 4 de liaison à l’octamère (Oct4), le cMyc et le facteur 4 de type Kruppel (Klf4).

Des cellules de fibroblastes embryonnaires de chauve-souris (BEF) ont été isolées de R. ferrumequinum avec des niveaux de facteurs de reprogrammation modifiés pour activer et bloquer plusieurs voies de signalisation. De plus, des analyses d’immunocoloration et de séquençage de l’acide ribonucléique (ARN) (RNA-seq) ont également été effectuées.

Obtention de cellules souches pluripotentes de chauves-souris. (A) Illustration de la stratégie d’obtention de cellules souches de chauve-souris pluripotentes. BEF, fibroblastes embryonnaires ; OSMK, 4 octobre, Sox2, cMyc, Klf4 ; FB, milieu fibroblastique ; PSC, milieu de cellules souches pluripotentes ; PSC+, PSC avec additifs. (B) Morphologie des colonies de cellules BiPS établies cultivées sur des fibroblastes embryonnaires de souris. (C) Détection par immunofluorescence d’Oct4 dans les cellules BiPS. (D) Terrain MA de données ARN-seq illustrant les différences transcriptionnelles entre les fibroblastes embryonnaires de chauve-souris (BEF) et les cellules souches pluripotentes (BiPS). Des gènes sélectionnés ayant des fonctions connues dans l'établissement ou le maintien de la pluripotence sont mis en évidence. (E) Analyse groupée Kmean des signaux ATAC-seq obtenus à partir de cellules BEF ou BiPS. C, grappes. (F), tracé de densité des résultats RRBS obtenus à partir de cellules BEF et BiPS. PCC, coefficient de corrélation de Pearson. (G) Nuages ​​de points de l’état de méthylation de l’histone 3 à K4 (activation de la modification de la chromatine) ou K27 (modification répressive de la chromatine) après ChIP-seq à partir de cellules BEF ou BiPS, comme indiqué. (H) Nuage de points de H3K4me3 et H3K27me3 dans les cellules BiPS illustrant la présence de sites de chromatine bivalente dans les cellules BiPS. (I) Signaux RNA-seq, ATAC-seq et H3K4me3 ou H3K27me3 ChIP-seq de gènes sélectionnés ayant des rôles connus dans la reprogrammation qui sont activés (Nanog, Kit) ou réprimés (Thy1) dans BiPS par rapport aux cellules BEF.

Les effets de la méthode de reprogrammation modifiée sur les molécules épigénétiques et la chromatine des chauves-souris ont été évalués à l’aide du test de chromatine accessible à la transposase avec séquençage (ATAC-seq). Des analyses de cartographie du méthylome de l'acide désoxyribonucléique (ADN) et des analyses d'immunoprécipitation et de séquençage de la chromatine (ChIP-seq) ont également été effectuées. Les protocoles ont été optimisés pour permettre la différenciation SC des chauves-souris en trois couches germinales, tandis qu'un test de différenciation du corps embryoïde (EB) a été réalisé pour évaluer la pluripotence.

Des iPSC de chauve-souris (BiPSC) ont ensuite été injectées à des souris immunodéprimées et des structures embryonnaires ont été créées à partir des BiPSC. Le protocole d’étude a été validé en développant des cellules BiPS à partir de la chauve-souris Myotis myotis, évolutivement éloignée.

Un profilage génétique transcriptionnel comparatif et des analyses en composantes principales (ACP) ont été réalisés chez l'espèce de chauve-souris Rhinolophus et chez des espèces de mammifères phylogénétiquement diverses telles que des souris, des humains, des chiens, des porcs et des ouistitis.

Une analyse de l'ontologie des gènes a été réalisée pour évaluer l'enrichissement génétique de pointe pour des voies biologiques spécifiques. De nouveaux pipelines ont été développés sur la base de la classification métagénomique des données séquencées par l'acide ribonucléique (ARN) des cellules souches (ARN-seq), de l'assemblage de contigs rétroviraux putatifs de novo et de la cartographie génomique pour identifier les lectures rétrovirales authentiques. De plus, les marqueurs antigéniques associés aux virus à ARN ont été examinés.

Résultats de l'étude

Un rapport de facteur de reprogrammation spécifique ainsi que l'ajout du facteur de croissance des fibroblastes-2 (Fgf-2), du facteur de cellules souches (Scf), du facteur inhibiteur de la leucémie (Lif) et de la forskoline au milieu de culture ont permis une croissance non inhibée des BiPSC, avec des colonies de chauves-souris homogènes et denses apparaissant en 14 à 16 jours.

Les BiPSC ont exprimé le facteur de pluripotence Oct4 à un taux de prolifération identique au taux de prolifération des CSP humaines. La plupart des cellules contenaient 56 chromosomes et se répliquaient sans facteurs de reprogrammation exogènes ni changements morphologiques.

Les BiPSC se sont différenciés en trois couches germinales et ont ensuite formé des EB et des organoïdes. L'analyse de l'ARN-seq a montré l'expression endogène induite de gènes canoniques liés à la pluripotence tels que SRY-2, Nanog et Oct4.

Cependant, le profil génétique n’était pas totalement cohérent avec un état de pluripotence. Au lieu de cela, des facteurs d’état pluripotents naïfs tels que Klf4 et 17, la protéine bêta du récepteur lié aux œstrogènes (Essrb), le facteur de transcription E3 (Tfe3) et le facteur de transcription CP2 Like 1 (Tfcp2l1) ont été exprimés. Des protéines coexprimées Tfcp2l1/doigt de zinc (Zic2) et Orthodenticle Homeobox 2 (Otx2)/Tfe3 ainsi que des facteurs amorcés/naïfs ont été observés.

Des changements dans la configuration de la chromatine et la méthylation du CpG 191 ont été observés dans tout le génome de la chauve-souris. Les résultats du ChiP-seq ont montré un chevauchement entre les gènes de bivalence des humains et des chauves-souris, bien que certains gènes soient spécifiques à une espèce.

Les BiPSC ont été reprogrammées transcriptionnellement et épigénétiquement. Les BIPSC étaient positifs pour les marqueurs de la protéine de boîte appariée (Pax6), du 213T et de l'alpha-fœtoprotéine (AFP) pour l'ectoderme, le mésoderme et l'endoderme.

Le gène ERAS était régulé négativement, alors que les gènes des hyaluronidases et des facteurs d'ADP-ribosylation (ARF) étaient impossibles à distinguer entre les groupes. Les blastoïdes de Rhinolophus présentaient des structures embryonnaires liées à une excroissance épithéliale trophoblastique aplatie et à une expansion de la masse cellulaire interne. Les résultats des chauves-souris Myotis suggèrent que le protocole d’étude pourrait être appliqué à différentes espèces de chauves-souris.

L’analyse PCA a révélé un groupe distinct de cellules souches de chauve-souris. Cependant, seuls huit gènes principaux ont présenté une sélection positive significative chez R. ferrumequinum, la plupart des gènes appartenant à des catégories inattendues. En outre, la maladie CoV était la catégorie la plus étendue de l’Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG).

Les gènes du collagène de type III alpha 1 (Col3a1) et de la mucine 1 (Muc1) ont été détectés dans les BiPSC, indiquant des adaptations génétiques spécifiques aux chauves-souris. La reprogrammation a révélé des séquences de rétrovirus endogènes (ERV).

Les BiPSC contenaient plusieurs séquences endogénéisées associées au virus avec des régions homologues à l'herpèsvirus humain 4, au virus respiratoire syncytial humain et à un isolat du SRAS-CoV-2. Les séquences génomiques de R. ferrumequinum étaient similaires à celles du CoV 229E humain et du CoV OC43 humain.

Plusieurs sites d'intégration rétroviraux homologues à des virus tels que le virus du singe Mason-Pfizer, le virus du koala et le rétrovirus du mouton Jaagsiekte ont été identifiés. Le génome était homologue aux virus du volépox, de la variole, de l'écureuil, de la variole du singe et du syndrome de la variole blanche.

Conclusions

Les séquences BiPSC étaient similaires aux séquences du génome viral. Ainsi, l’état de pluripotence transcriptionnellement permissive des chauves-souris pourrait être exploité pour découvrir de nouvelles séquences de virus de chauve-souris impliquées dans la physiologie des chauves-souris et leurs capacités d’hébergement de virus.

Cet article de presse était une revue d'un rapport scientifique préliminaire qui n'avait pas été évalué par des pairs au moment de la publication. Depuis sa publication initiale, le rapport scientifique a été évalué par des pairs et accepté pour publication dans une revue universitaire. Des liens vers les rapports préliminaires et évalués par des pairs se trouvent dans la section Sources à la fin de cet article. Afficher les sources

Références :

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Dejosez, M., Marin, A., Hughes, GM, et al. (2022). Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren einzigartige Verflechtung zwischen Wirt und Viren. bioRxiv. doi:10.1101/2022.09.23.509261. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.23.509261v1.
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Déjosez, Marion, Arturo Marin, Graham M. Hughes, Ariadna E. Morales, Carlos Godoy-Parejo, Jonathan L. Gray, Yiren Qin, et al. 2023. „Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren ungewöhnliche Verflechtung zwischen Wirt und Viren.“ Zelle 186 (5): 957-974.e28. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.01.011. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867423000417.

Révisions d'articles

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.