Pluripotentne matične stanice šišmiša kao model za proučavanje novih virusa

Pluripotentne matične stanice šišmiša kao model za proučavanje novih virusa

Šišmiši su evoluirali s jedinstvenim značajkama kao što su laringealna eholokacija i let, a neki mogu tolerirati viruse poput koronavirusa teškog akutnog respiratornog sindroma (SARS-CoV), respiratornog sindroma Bliskog istoka (MERS-CoV) i virusa Marburg i Nipah. Razvoj robusnih staničnih modela šišmiša mogao bi dovesti do boljeg razumijevanja upravljanja virusima šišmiša i njihove biologije.

U nedavno objavljenoj studiji na tu temu bioRxiv * Poslužitelj preprinta: Istraživači su generirali inducirane pluripotentne matične stanice (iPSC) iz šišmiša Rhinolophus ferrumequinum koristeći modificirani Yamanaka protokol kako bi ustanovili šišmiše kao novu in vivo modelsku vrstu.

Studija: Pluripotentne matične stanice šišmiša otkrivaju jedinstvenu međupovezanost domaćina i virusa.Autor fotografije: Jezper / Shutterstock.com

Ovaj novinski članak bio je pregled preliminarnog znanstvenog izvješća koje nije bilo recenzirano u vrijeme objavljivanja. Od svoje prve objave, znanstveno izvješće sada je recenzirano i prihvaćeno za objavljivanje u akademskom časopisu. Veze na preliminarna i recenzirana izvješća mogu se pronaći u odjeljku Izvori na kraju ovog članka. Pogledaj izvore

O studiju

U ovoj studiji istraživači istražuju mogu li šišmiši biti prikladni za proizvodnju virusa.

Pristup reprogramiranja Yamanaka korišten je na temelju čimbenika reprogramiranja kao što su Y-box-2 gen za regiju koja određuje spol, transkripcijski faktor 4 (Oct4) koji veže oktamer, cMyc i Kruppelov faktor 4 (Klf4).

Stanice fibroblasta embrija šišmiša (BEF) izolirane su iz bakterije R. ferrumequinum s promijenjenim razinama faktora reprogramiranja da aktiviraju i blokiraju višestruke signalne putove. Osim toga, također su provedene analize imunološkog bojenja i sekvenciranja ribonukleinske kiseline (RNA) (RNA-seq).

Dobivanje pluripotentnih matičnih stanica šišmiša. (A) Ilustracija strategije za dobivanje pluripotentnih matičnih stanica šišmiša. BEF, embrionalni fibroblasti; OSMK, Oct4, Sox2, cMyc, Klf4; FB, fibroblastni medij; PSC, medij pluripotentnih matičnih stanica; PSC+, PSC s dodacima. (B) Morfologija uspostavljenih BiPS staničnih kolonija uzgojenih na mišjim embrionalnim fibroblastima. (C) Imunofluorescentna detekcija Oct4 u BiPS stanicama. (D) MA dijagram RNA-seq podataka koji ilustrira transkripcijske razlike između fibroblasta embrija šišmiša (BEF) i pluripotentnih matičnih stanica (BiPS). Istaknuti su odabrani geni s poznatim funkcijama u uspostavljanju ili održavanju pluripotencije. (E) Ksrednja analiza klastera ATAC-seq signala dobivenih iz BEF ili BiPS stanica. C, grozdovi. (F), Grafik gustoće RRBS rezultata dobivenih iz BEF i BiPS stanica. PCC, Pearsonov koeficijent korelacije. (G) Dijagrami raspršenosti statusa metilacije histona 3 na K4 (aktivirajuća modifikacija kromatina) ili K27 (represivna modifikacija kromatina) nakon ChIP-seq iz BEF ili BiPS stanica, kako je naznačeno. (H) Dijagram raspršenosti H3K4me3 i H3K27me3 u BiPS stanicama koji ilustrira prisutnost mjesta dvovalentnog kromatina u BiPS stanicama. (I) RNA-seq, ATAC-seq i H3K4me3 ili H3K27me3 ChIP-seq signali odabranih gena s poznatim ulogama u reprogramiranju koji su aktivirani (Nanog, Kit) ili potisnuti (Thy1) u BiPS u usporedbi s BEF stanicama.

Učinci modificirane metode reprogramiranja na epigenetske molekule i kromatin šišmiša procijenjeni su korištenjem kromatina dostupnog transpozazi sa sekvenciranjem (ATAC-seq). Također su provedene analize mapiranja metiloma dezoksiribonukleinske kiseline (DNA) i analize imunoprecipitacije i sekvenciranja kromatina (ChIP-seq). Protokoli su optimizirani kako bi se omogućila SC diferencijacija šišmiša u tri klicina lista, dok je test diferencijacije tijela embrija (EB) proveden za procjenu pluripotencije.

Šišmiši iPSC (BiPSC) zatim su ubrizgani u imunosuprimirane miševe i embrionalne strukture stvorene su iz BiPSC. Protokol studije potvrđen je razvojem BiPS stanica iz evolucijski udaljenog šišmiša Myotis myotis.

Usporedno transkripcijsko profiliranje gena i analiza glavnih komponenti (PCA) provedena je kod vrste šišmiša Rhinolophus i filogenetski raznolikih vrsta sisavaca miševa, ljudi, pasa, svinja i marmozeta.

Analiza genske ontologije provedena je kako bi se procijenilo najsuvremenije obogaćivanje gena za specifične biološke putove. Razvijeni su novi cjevovodi na temelju metagenomske klasifikacije matičnih stanica sekvenciranih (RNA-seq) podataka ribonukleinske kiseline (RNA), de novo pretpostavljenog retrovirusnog kontig skupa i genomskog mapiranja za identifikaciju bona fide retrovirusnih očitavanja. Osim toga, ispitani su antigenski markeri povezani s RNA virusima.

Rezultati studije

Specifični omjer faktora reprogramiranja kao i dodatak faktora rasta fibroblasta-2 (Fgf-2), faktora matičnih stanica (Scf), faktora inhibicije leukemije (Lif) i forskolina u medij kulture omogućio je neinhibiran rast BiPSC, s homogenim i gustim kolonijama šišmiša koje su se pojavile unutar 14 do 16 dana.

BiPSC su izrazili faktor pluripotencije Oct4 pri stopi proliferacije identičnoj stopi proliferacije ljudskih PSC. Većina stanica sadržavala je 56 kromosoma i replicirala se bez egzogenih faktora reprogramiranja i morfoloških promjena.

BiPSC su se diferencirali u tri klicina listića i nakon toga formirali EB-ove i organoide. RNA-seq analiza pokazala je induciranu endogenu ekspresiju kanonskih gena povezanih s pluripotencijom kao što su SRY-2, Nanog i Oct4.

Međutim, genetski profil nije bio u potpunosti u skladu sa stanjem pluripotencije. Umjesto toga, izraženi su naivni faktori pluripotentnog stanja kao što su Klf4 i 17, beta protein receptora povezanog s estrogenom (Essrb), transkripcijski faktor E3 (Tfe3) i transkripcijski faktor CP2 Like 1 (Tfcp2l1). Opaženi su koeksprimirani Tfcp2l1/protein cinkovog prsta (Zic2) i Orthodenticle Homeobox 2 (Otx2)/Tfe3 kao i primarni/naivni faktori.

Promjene u konfiguraciji kromatina i metilaciji CpG 191 uočene su u cijelom genomu šišmiša. ChiP-seq rezultati pokazali su preklapanje između gena bivalencije čovjeka i šišmiša, iako su neki geni bili specifični za vrstu.

BiPSC su transkripcijski i epigenetski reprogramirani. BIPSC su bili pozitivni na markere uparenog box proteina (Pax6), 213T i alfa-fetoproteina (AFP) za ektoderm, mezoderm i endoderm.

Gen ERAS bio je smanjen, dok se geni za hijaluronidaze i faktore ADP-ribozilacije (ARF) nisu razlikovali između skupina. Rhinolophus blastoidi pokazali su embrionalne strukture vezane za spljošteni trofoblastični epitelni rast i unutarnju ekspanziju stanične mase. Rezultati šišmiša Myotis sugeriraju da se protokol studije može primijeniti na različite vrste šišmiša.

PCA analiza otkrila je posebnu skupinu matičnih stanica šišmiša. Međutim, samo osam vrhunskih gena pokazalo je značajnu pozitivnu selekciju kod R. ferrumequinum, pri čemu je većina gena pripadala neočekivanim kategorijama. Nadalje, CoV bolest bila je najznačajnije proširena kategorija u Kyoto enciklopediji gena i genoma (KEGG).

Geni kolagena tipa III alfa 1 (Col3a1) i mucina 1 (Muc1) otkriveni su u BiPSC-ima, što ukazuje na genetske prilagodbe specifične za šišmiše. Reprogramiranje je otkrilo sekvence endogenog retrovirusa (ERV).

BiPSC-ovi su sadržavali više endogeniziranih sekvenci povezanih s virusom s regijama homolognim ljudskom herpesvirusu 4, ljudskom respiratornom sincicijskom virusu i izolatu SARS-CoV-2. Genomske sekvence bakterije R. ferrumequinum bile su slične onima humanog CoV 229E i ljudskog CoV OC43.

Identificirano je nekoliko retrovirusnih integracijskih mjesta koja su bila homologna virusima kao što su virus majmuna Mason-Pfizer, virus koale i retrovirus ovaca Jaagsiekte. Genom je bio homologan virusima volepox, variola, vjeveričje boginje, majmunske boginje i sindrom bijelih boginja.

Zaključci

BiPSC sekvence bile su slične sekvencama virusnog genoma. Stoga bi se transkripcijsko permisivno stanje pluripotencije šišmiša moglo iskoristiti za otkrivanje novih sekvenci virusa šišmiša uključenih u fiziologiju šišmiša i njihove sposobnosti udomljavanja virusa.

Ovaj novinski članak bio je pregled preliminarnog znanstvenog izvješća koje nije bilo recenzirano u vrijeme objavljivanja. Od svoje prve objave, znanstveno izvješće sada je recenzirano i prihvaćeno za objavljivanje u akademskom časopisu. Veze na preliminarna i recenzirana izvješća mogu se pronaći u odjeljku Izvori na kraju ovog članka. Pogledaj izvore

Reference:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Dejosez, M., Marin, A., Hughes, GM, et al. (2022). Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren einzigartige Verflechtung zwischen Wirt und Viren. bioRxiv. doi:10.1101/2022.09.23.509261. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.23.509261v1.
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Déjosez, Marion, Arturo Marin, Graham M. Hughes, Ariadna E. Morales, Carlos Godoy-Parejo, Jonathan L. Gray, Yiren Qin, et al. 2023. „Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren ungewöhnliche Verflechtung zwischen Wirt und Viren.“ Zelle 186 (5): 957-974.e28. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.01.011. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867423000417.

Revizije članaka

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.