Pluripotens denevér őssejtek modellként új vírusok tanulmányozásához

Pluripotens denevér őssejtek modellként új vírusok tanulmányozásához

A denevérek olyan egyedi tulajdonságokkal fejlődtek, mint a gége visszhangosodása és repülése, és néhányan képesek elviselni a vírusokat, például a súlyos akut légúti szindróma koronavírusokat (SARS-CoV), a közel-keleti légúti szindróma CoV-kat (MERS-CoV), valamint a Marburg és Nipah vírusokat. A robusztus sejtalapú denevérmodellek kifejlesztése a denevérvírus kezelésének és biológiájának jobb megértéséhez vezethet.

A témában nemrég megjelent tanulmányban bioRxiv * Preprint szerver: A kutatók indukált pluripotens őssejteket (iPSC) hoztak létre Rhinolophus ferrumequinum denevérekből a módosított Yamanaka protokoll segítségével, hogy a denevéreket új in vivo modellvizsgálati fajként hozták létre.

Tanulmány: A denevér pluripotens őssejtek egyedülálló gazda-vírus összekapcsolódást mutatnak.Fotó forrása: Jezper / Shutterstock.com

Ez a hírcikk egy előzetes tudományos jelentés áttekintése volt, amelyet a közzététel időpontjában még nem értékeltek szakértők. Az első megjelenés óta a tudományos jelentést szakértői lektoráltak, és elfogadták egy tudományos folyóiratban való közzétételre. Az előzetes és a lektorált jelentésekre mutató hivatkozások a cikk végén található Források részben találhatók. Források megtekintése

A tanulmányról

Jelen tanulmányban a kutatók azt vizsgálják, hogy a denevérek alkalmasak lehetnek-e vírustermelésre.

A Yamanaka újraprogramozási megközelítést olyan újraprogramozási faktorok alapján alkalmazták, mint a nemet meghatározó régió Y-box-2 génje, az oktamerkötő 4-es transzkripciós faktor (Oct4), a cMyc és a Kruppel-szerű 4-es faktor (Klf4).

A denevér embrionális fibroblaszt (BEF) sejteket R. ferrumequinumból izoláltuk úgy, hogy az újraprogramozó faktorok szintjét megváltoztatták, hogy aktiváljanak és blokkoljanak több jelátviteli útvonalat. Emellett immunfestés és ribonukleinsav (RNS) szekvenálás (RNS-seq) elemzéseket is végeztünk.

Pluripotens denevér őssejtek beszerzése. (A) A pluripotens denevér őssejtek megszerzésének stratégiája. BEF, embrionális fibroblasztok; OSMK, Oct4, Sox2, cMyc, Klf4; FB, fibroblaszt táptalaj; PSC, pluripotens őssejt táptalaj; PSC+, PSC adalékokkal. (B) Egér embrionális fibroblasztokon tenyésztett kialakult BiPS-sejtkolóniák morfológiája. (C) Az Oct4 immunfluoreszcens kimutatása BiPS sejtekben. (D) RNS-seq adatok MA diagramja, amely szemlélteti a denevér embrionális fibroblasztok (BEF) és a pluripotens őssejtek (BiPS) közötti transzkripciós különbségeket. A kiválasztott gének a pluripotencia kialakításában vagy fenntartásában ismert funkciókkal rendelkeznek. (E) BEF vagy BiPS sejtekből nyert ATAC-seq jelek Kmean klaszteranalízise. C, klaszterek. (F), a BEF és BiPS sejtekből nyert RRBS eredmények sűrűségdiagramja. PCC, Pearson korrelációs együttható. (G) A hiszton 3 metilációs állapotának szórásdiagramja K4-nél (aktiváló kromatin-módosítás) vagy K27-nél (represszív kromatin-módosítás) a BEF- vagy BiPS-sejtekből származó ChIP-seq után, a jelzett módon. (H) A H3K4me3 és H3K27me3 szórásdiagramja BiPS sejtekben, amely szemlélteti a bivalens kromatin helyek jelenlétét a BiPS sejtekben. (I) A kiválasztott gének RNS-seq, ATAC-seq és H3K4me3 vagy H3K27me3 ChIP-seq jelei, amelyek ismert szerepet játszanak az újraprogramozásban, aktiválva (Nanog, Kit) vagy elnyomva (Thy1) a BiPS-ben a BEF sejtekhez képest.

A módosított újraprogramozási módszer hatását a denevér epigenetikai molekulákra és a kromatinra a transzpozázhoz hozzáférhető kromatin szekvenálásos (ATAC-seq) assay segítségével értékeltük. Dezoxiribonukleinsav (DNS) metilóm-térképezési analíziseket és kromatin immunprecipitációs és szekvenálási (ChIP-seq) elemzéseket is végeztünk. A protokollokat úgy optimalizálták, hogy lehetővé tegyék a denevérek SC differenciálódását a három csírarétegbe, míg az embrioid test (EB) differenciálódási vizsgálatot a pluripotencia értékelésére végezték.

Ezután denevér iPSC-ket (BiPSC-ket) injektáltak immunszuppresszált egerekbe, és embrionális struktúrákat hoztak létre a BiPSC-kből. A vizsgálati protokollt az evolúciósan távoli Myotis myotis denevérből származó BiPS-sejtek kifejlesztésével validálták.

Összehasonlító transzkripciós génprofilozást és főkomponens-analízist (PCA) végeztek a Rhinolophus denevérfajokon és a filogenetikailag változatos emlősfajokon: egér, ember, kutya, sertés és selyemmajka.

Génontológiai elemzést végeztek annak érdekében, hogy felmérjék a legkorszerűbb géngazdagodást specifikus biológiai útvonalakra vonatkozóan. Új csővezetékeket fejlesztettek ki az őssejt-ribonukleinsav (RNS) szekvenciájú (RNS-seq) adatok metagenomikus osztályozása, de novo feltételezett retrovírus kontig összeállítás és genomi térképezés alapján a jóhiszemű retrovírus leolvasások azonosítására. Ezenkívül megvizsgálták az RNS-vírusokhoz kapcsolódó antigénmarkereket.

Tanulmányi eredmények

A specifikus újraprogramozási faktor arány, valamint a fibroblaszt növekedési faktor-2 (Fgf-2), őssejt faktor (Scf), leukémia gátló faktor (Lif) és forskolin hozzáadása a táptalajhoz lehetővé tette a gátlástalan BiPSC növekedést, homogén és sűrű denevérkolóniák megjelenésével 14-16 napon belül.

A BiPSC-k az Oct4 pluripotencia faktort a humán PSC-k proliferációs sebességével azonos proliferációs sebességgel fejezték ki. A legtöbb sejt 56 kromoszómát tartalmazott, és exogén átprogramozási faktorok és morfológiai változások nélkül replikálódott.

A BiPSC-k három csírarétegre differenciálódtak, és ezt követően EB-ket és organoidokat képeztek. Az RNS-seq elemzés a kanonikus pluripotenciával kapcsolatos gének, például az SRY-2, a Nanog és az Oct4 indukált endogén expresszióját mutatta ki.

A genetikai profil azonban nem volt teljesen összhangban a pluripotencia állapottal. Ehelyett naiv pluripotens állapotfaktorok, például Klf4 és 17, ösztrogénnel rokon receptor béta-fehérje (Essrb), E3 transzkripciós faktor (Tfe3) és CP2 Like 1 (Tfcp2l1) transzkripciós faktor expresszálódott. Koexpresszált Tfcp2l1/cink ujjfehérje (Zic2) és Orthodenticle Homeobox 2 (Otx2)/Tfe3, valamint primed/naiv faktorok figyelhetők meg.

A kromatinkonfiguráció és a CpG 191 metiláció változásait figyelték meg a denevér genomjában. A ChiP-seq eredmények átfedést mutattak az emberi és a denevér bivalencia gének között, bár egyes gének fajspecifikusak voltak.

A BiPSC-ket transzkripciósan és epigenetikailag újraprogramozták. A BIPSC-k pozitívnak bizonyultak az ektoderma, mezoderma és endoderma párosított dobozfehérje (Pax6), 213T és alfa-fetoprotein (AFP) markereire.

Az ERAS gén leszabályozott, míg a hialuronidázok és az ADP-ribozilációs faktorok (ARF) génjei nem voltak megkülönböztethetők a csoportok között. A Rhinolophus blasztoidok embrionális struktúrákat mutattak, amelyek egy lapított trofoblasztikus epiteliális kinövéshez és belső sejttömeg-növekedéshez kötődnek. A Myotis denevér eredményei arra utaltak, hogy a vizsgálati protokoll különböző denevérfajokra alkalmazható.

A PCA-elemzés a denevér őssejtek egy külön csoportját tárta fel. Mindazonáltal csak nyolc felső gén mutatott szignifikáns pozitív szelekciót R. ferrumequinumban, a legtöbb gén nem várt kategóriákba tartozik. Ezenkívül a CoV-betegség volt a legjelentősebben kibővített kategória a kiotói gének és genomok enciklopédiájában (KEGG).

A III-as típusú kollagén alfa 1 (Col3a1) és mucin 1 (Muc1) géneket BiPSC-ben mutatták ki, ami denevér-specifikus genetikai adaptációra utal. Az újraprogramozás endogén retrovírus (ERV) szekvenciákat tárt fel.

A BiPSC-k több vírussal kapcsolatos endogenizált szekvenciát tartalmaztak, amelyekben a humán herpeszvírus 4-gyel, a humán respiratorikus syncytialis vírussal és egy SARS-CoV-2 izolátummal homológ régiók voltak. Az R. ferrumequinum genomiális szekvenciái hasonlóak voltak a humán CoV 229E és a humán CoV OC43 szekvenciáihoz.

Számos retrovírus-integrációs helyet azonosítottak, amelyek homológok voltak olyan vírusokkal, mint a Mason-Pfizer majomvírus, a koalavírus és a Jaagsiekte juh retrovírus. A genom homológ volt a volepox, a variola, a mókushimlő, a majomhimlő és a fehérhimlő szindróma vírusokkal.

Következtetések

A BiPSC szekvenciák hasonlóak voltak a vírus genom szekvenciáihoz. Így a denevérek transzkripciósan megengedő pluripotencia állapota kihasználható új denevérvírus-szekvenciák felfedezésére, amelyek részt vesznek a denevérek fiziológiájában és vírusgazda képességeikben.

Ez a hírcikk egy előzetes tudományos jelentés áttekintése volt, amelyet a közzététel időpontjában még nem értékeltek szakértők. Az első megjelenés óta a tudományos jelentést szakértői lektoráltak, és elfogadták egy tudományos folyóiratban való közzétételre. Az előzetes és a lektorált jelentésekre mutató hivatkozások a cikk végén található Források részben találhatók. Források megtekintése

Referenciák:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Dejosez, M., Marin, A., Hughes, GM, et al. (2022). Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren einzigartige Verflechtung zwischen Wirt und Viren. bioRxiv. doi:10.1101/2022.09.23.509261. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.23.509261v1.
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Déjosez, Marion, Arturo Marin, Graham M. Hughes, Ariadna E. Morales, Carlos Godoy-Parejo, Jonathan L. Gray, Yiren Qin, et al. 2023. „Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren ungewöhnliche Verflechtung zwischen Wirt und Viren.“ Zelle 186 (5): 957-974.e28. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.01.011. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867423000417.

Cikk átdolgozások

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.