Cellule staminali pluripotenti di pipistrello come modello per lo studio di nuovi virus

Cellule staminali pluripotenti di pipistrello come modello per lo studio di nuovi virus

I pipistrelli si sono evoluti con caratteristiche uniche come l’ecolocalizzazione laringea e il volo, con alcuni in grado di tollerare virus come i coronavirus della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV), la sindrome respiratoria del Medio Oriente CoV (MERS-CoV) e i virus Marburg e Nipah. Lo sviluppo di robusti modelli di pipistrelli basati su cellule potrebbe portare a una migliore comprensione della gestione dei virus dei pipistrelli e della loro biologia.

In uno studio recentemente pubblicato sull’argomento bioRxiv * Server di prestampa: i ricercatori hanno generato cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da pipistrelli Rhinolophus ferrumequinum utilizzando il protocollo Yamanaka modificato per stabilire i pipistrelli come una nuova specie di studio modello in vivo.

Studio: Le cellule staminali pluripotenti del pipistrello rivelano un'interconnessione ospite-virus unica.Credito fotografico: Jezper/Shutterstock.com

Questo articolo di notizie era una revisione di un rapporto scientifico preliminare che non era stato sottoposto a revisione paritaria al momento della pubblicazione. Dalla sua pubblicazione iniziale, il rapporto scientifico è stato ora sottoposto a revisione paritaria e accettato per la pubblicazione in una rivista accademica. I collegamenti ai rapporti preliminari e sottoposti a revisione paritaria possono essere trovati nella sezione Fonti alla fine di questo articolo. Visualizza fonti

A proposito dello studio

Nel presente studio, i ricercatori stanno studiando se i pipistrelli potrebbero essere adatti alla produzione di virus.

L'approccio di riprogrammazione Yamanaka è stato utilizzato sulla base di fattori di riprogrammazione come il gene Y-box-2 della regione che determina il sesso, il fattore di trascrizione legante l'ottamero 4 (Oct4), cMyc e il fattore 4 simile a Kruppel (Klf4).

Cellule di fibroblasti embrionali di pipistrello (BEF) sono state isolate da R. ferrumequinum con livelli di fattori di riprogrammazione alterati per attivare e bloccare molteplici vie di segnalazione. Inoltre, sono state eseguite anche analisi di immunocolorazione e sequenziamento dell'acido ribonucleico (RNA) (RNA-seq).

Ottenere cellule staminali pluripotenti di pipistrello. (A) Illustrazione della strategia per ottenere cellule staminali di pipistrello pluripotenti. BEF, fibroblasti embrionali; OSMK, Oct4, Sox2, cMyc, Klf4; FB, mezzo fibroblastico; PSC, mezzo per cellule staminali pluripotenti; PSC+, PSC con additivi. (B) Morfologia di colonie di cellule BiPS stabilite coltivate su fibroblasti embrionali di topo. (C) Rilevamento mediante immunofluorescenza di Oct4 nelle cellule BiPS. (D) Grafico MA dei dati RNA-seq che illustrano le differenze trascrizionali tra fibroblasti embrionali di pipistrello (BEF) e cellule staminali pluripotenti (BiPS). Vengono evidenziati i geni selezionati con funzioni note nello stabilire o mantenere la pluripotenza. (E) Analisi cluster Kmean dei segnali ATAC-seq ottenuti da cellule BEF o BiPS. C, cluster. (F), grafico della densità dei risultati RRBS ottenuti da cellule BEF e BiPS. PCC, coefficiente di correlazione di Pearson. (G) Grafici a dispersione dello stato di metilazione dell'istone 3 su K4 (attivazione della modifica della cromatina) o K27 (modificazione repressiva della cromatina) dopo ChIP-seq da cellule BEF o BiPS, come indicato. (H) Grafico a dispersione di H3K4me3 e H3K27me3 nelle cellule BiPS che illustra la presenza di siti di cromatina bivalente nelle cellule BiPS. (I) Segnali ChIP-seq RNA-seq, ATAC-seq e H3K4me3 o H3K27me3 di geni selezionati con ruoli noti nella riprogrammazione che sono attivati ​​(Nanog, Kit) o ​​repressi (Thy1) in BiPS rispetto alle cellule BEF.

Gli effetti del metodo di riprogrammazione modificato sulle molecole epigenetiche dei pipistrelli e sulla cromatina sono stati valutati utilizzando il test della cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento (ATAC-seq). Sono state inoltre eseguite analisi di mappatura del metiloma dell'acido desossiribonucleico (DNA) e analisi di immunoprecipitazione e sequenziamento della cromatina (ChIP-seq). I protocolli sono stati ottimizzati per consentire la differenziazione SC dei pipistrelli nei tre strati germinali, mentre è stato eseguito il test di differenziazione del corpo embrioide (EB) per valutare la pluripotenza.

Le iPSC di pipistrello (BiPSC) sono state quindi iniettate in topi immunodepressi e dalle BiPSC sono state create strutture embrionali. Il protocollo di studio è stato convalidato sviluppando cellule BiPS dal pipistrello evolutivamente distante Myotis myotis.

Il profilo genetico trascrizionale comparativo e l'analisi delle componenti principali (PCA) sono stati eseguiti nella specie di pipistrelli Rhinolophus e in specie di mammiferi filogeneticamente diverse di topi, esseri umani, cani, maiali e uistitì.

È stata eseguita l'analisi dell'ontologia genetica per valutare l'arricchimento genetico all'avanguardia per specifici percorsi biologici. Sono state sviluppate nuove pipeline sulla base della classificazione metagenomica dei dati sequenziati dell'acido ribonucleico (RNA) delle cellule staminali (RNA-seq), dell'assemblaggio contig retrovirale presunto de novo e della mappatura genomica per identificare le letture retrovirali in buona fede. Inoltre, sono stati esaminati i marcatori antigenici associati ai virus a RNA.

Risultati dello studio

Uno specifico rapporto tra i fattori di riprogrammazione e l'aggiunta del fattore di crescita dei fibroblasti 2 (Fgf-2), del fattore delle cellule staminali (Scf), del fattore inibitorio della leucemia (Lif) e della forskolina al terreno di coltura hanno consentito la crescita disinibita del BiPSC, con colonie di pipistrelli omogenee e dense che compaiono entro 14-16 giorni.

Le BiPSC esprimevano il fattore di pluripotenza Oct4 a un tasso di proliferazione identico al tasso di proliferazione delle PSC umane. La maggior parte delle cellule conteneva 56 cromosomi e si replicava senza fattori di riprogrammazione esogeni e cambiamenti morfologici.

I BiPSC si sono differenziati nei tre strati germinali e successivamente hanno formato EB e organoidi. L'analisi dell'RNA-seq ha mostrato un'espressione endogena indotta di geni canonici correlati alla pluripotenza come SRY-2, Nanog e Oct4.

Tuttavia, il profilo genetico non era del tutto coerente con uno stato di pluripotenza. Invece, sono stati espressi fattori di stato pluripotenti naïve come Klf4 e 17, la proteina beta del recettore correlato agli estrogeni (Essrb), il fattore di trascrizione E3 (Tfe3) e il fattore di trascrizione CP2 Like 1 (Tfcp2l1). Sono stati osservati fattori coespressi Tfcp2l1/zinc finger (Zic2) e Orthodenticle Homeobox 2 (Otx2)/Tfe3, nonché fattori innescati/naïve.

Cambiamenti nella configurazione della cromatina e nella metilazione di CpG 191 sono stati osservati in tutto il genoma del pipistrello. I risultati ChiP-seq hanno mostrato una sovrapposizione tra i geni di bivalenza umani e quelli dei pipistrelli, sebbene alcuni geni fossero specie-specifici.

Le BiPSC sono state riprogrammate trascrizionalmente ed epigeneticamente. I BIPSC erano positivi per i marcatori della proteina box accoppiata (Pax6), 213T e alfa-fetoproteina (AFP) per ectoderma, mesoderma ed endoderma.

Il gene ERAS era sottoregolato, mentre i geni per le ialuronidasi e i fattori di ribosilazione dell'ADP (ARF) erano indistinguibili tra i gruppi. I blastoidi del Rhinolophus mostravano strutture embrionali legate a una crescita epiteliale trofoblastica appiattita e ad un'espansione della massa cellulare interna. I risultati dei pipistrelli Myotis hanno suggerito che il protocollo di studio potrebbe essere applicato a diverse specie di pipistrelli.

L'analisi PCA ha rivelato un gruppo distinto di cellule staminali di pipistrello. Tuttavia, solo otto geni principali hanno mostrato una selezione positiva significativa in R. ferrumequinum, con la maggior parte dei geni appartenenti a categorie inaspettate. Inoltre, la malattia CoV è stata la categoria più significativamente ampliata nell’Enciclopedia di geni e genomi di Kyoto (KEGG).

I geni del collagene di tipo III alfa 1 (Col3a1) e della mucina 1 (Muc1) sono stati rilevati nelle BiPSC, indicando adattamenti genetici specifici del pipistrello. La riprogrammazione ha rivelato sequenze di retrovirus endogeni (ERV).

I BiPSC contenevano più sequenze endogene associate al virus con regioni omologhe all’herpesvirus umano 4, al virus respiratorio sinciziale umano e a un isolato SARS-CoV-2. Le sequenze genomiche di R. ferrumequinum erano simili a quelle del CoV 229E umano e del CoV OC43 umano.

Sono stati identificati diversi siti di integrazione retrovirale che erano omologhi a virus come il virus della scimmia Mason-Pfizer, il virus del koala e il retrovirus della pecora Jaagsiekte. Il genoma era omologo ai virus della sindrome del volepox, del variola, dello scoiattolo, del vaiolo delle scimmie e del vaiolo bianco.

Conclusioni

Le sequenze BiPSC erano simili alle sequenze del genoma virale. Pertanto, lo stato di pluripotenza trascrizionalmente permissivo dei pipistrelli potrebbe essere sfruttato per scoprire nuove sequenze di virus dei pipistrelli coinvolte nella fisiologia dei pipistrelli e nelle loro capacità di ospitare virus.

Questo articolo di notizie era una revisione di un rapporto scientifico preliminare che non era stato sottoposto a revisione paritaria al momento della pubblicazione. Dalla sua pubblicazione iniziale, il rapporto scientifico è stato ora sottoposto a revisione paritaria e accettato per la pubblicazione in una rivista accademica. I collegamenti ai rapporti preliminari e sottoposti a revisione paritaria possono essere trovati nella sezione Fonti alla fine di questo articolo. Visualizza fonti

Riferimenti:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Dejosez, M., Marin, A., Hughes, GM, et al. (2022). Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren einzigartige Verflechtung zwischen Wirt und Viren. bioRxiv. doi:10.1101/2022.09.23.509261. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.23.509261v1.
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Déjosez, Marion, Arturo Marin, Graham M. Hughes, Ariadna E. Morales, Carlos Godoy-Parejo, Jonathan L. Gray, Yiren Qin, et al. 2023. „Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren ungewöhnliche Verflechtung zwischen Wirt und Viren.“ Zelle 186 (5): 957-974.e28. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.01.011. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867423000417.

Revisioni degli articoli

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.