Pluripotentinės šikšnosparnių kamieninės ląstelės kaip naujų virusų tyrimo modelis

Pluripotentinės šikšnosparnių kamieninės ląstelės kaip naujų virusų tyrimo modelis

Šikšnosparniai išsivystė su unikaliomis savybėmis, tokiomis kaip gerklų echolokacija ir skrydis, kai kurie gali toleruoti tokius virusus kaip sunkus ūminio kvėpavimo sindromo koronavirusas (SARS-CoV), Artimųjų Rytų kvėpavimo sindromo CoV (MERS-CoV) ir Marburgo bei Nipah virusai. Sukūrus tvirtus ląstelių pagrindu sukurtus šikšnosparnių modelius, būtų galima geriau suprasti šikšnosparnių virusų valdymą ir jų biologiją.

Neseniai paskelbtame tyrime šia tema bioRxiv * Išankstinio spausdinimo serveris: tyrėjai sukūrė indukuotas pluripotentines kamienines ląsteles (iPSC) iš Rhinolophus ferrumequinum šikšnosparnių, naudodamiesi modifikuotu Yamanaka protokolu, kad šikšnosparniai būtų nauja in vivo modelio tyrimo rūšis.

Tyrimas: Šikšnosparnio pluripotentinės kamieninės ląstelės atskleidžia unikalų šeimininko ir viruso tarpusavio ryšį.Nuotraukų kreditas: Jezper / Shutterstock.com

Šis naujienų straipsnis buvo išankstinės mokslinės ataskaitos, kuri publikavimo metu nebuvo recenzuota, apžvalga. Nuo pat pirminio paskelbimo mokslinė ataskaita buvo recenzuojama ir priimta publikuoti akademiniame žurnale. Nuorodos į preliminarias ir recenzuotas ataskaitas rasite skiltyje Šaltiniai šio straipsnio pabaigoje. Žiūrėti šaltinius

Apie studiją

Šiame tyrime mokslininkai tiria, ar šikšnosparniai gali būti tinkami virusų gamybai.

Yamanaka perprogramavimo metodas buvo naudojamas remiantis perprogramavimo veiksniais, tokiais kaip lytį lemiantis Y-box-2 genas, oktamerą surišantis transkripcijos faktorius 4 (Oct4), cMyc ir Kruppel panašus faktorius 4 (Klf4).

Šikšnosparnio embrioninių fibroblastų (BEF) ląstelės buvo išskirtos iš R. ferrumequinum su pakeistų perprogramavimo faktorių lygiais, kad aktyvuotų ir blokuotų kelis signalizacijos kelius. Be to, taip pat buvo atlikta imuninio dažymo ir ribonukleino rūgšties (RNR) sekos (RNR-seq) analizė.

Pluripotentinių šikšnosparnių kamieninių ląstelių gavimas. (A) Pluripotentinių šikšnosparnių kamieninių ląstelių gavimo strategijos iliustracija. BEF, embrioniniai fibroblastai; OSMK, Oct4, Sox2, cMyc, Klf4; FB, fibroblastų terpė; PSC, pluripotentinė kamieninių ląstelių terpė; PSC+, PSC su priedais. (B) Nustatytų BiPS ląstelių kolonijų, auginamų ant pelių embrioninių fibroblastų, morfologija. (C) Oct4 imunofluorescencinis aptikimas BiPS ląstelėse. (D) RNR-seq duomenų MA diagrama, iliustruojanti transkripcijos skirtumus tarp šikšnosparnių embrioninių fibroblastų (BEF) ir pluripotentinių kamieninių ląstelių (BiPS). Paryškinami pasirinkti genai, turintys žinomų funkcijų nustatant ar palaikant pluripotenciją. (E) ATAC-seq signalų, gautų iš BEF arba BiPS ląstelių, Kmean klasterio analizė. C, klasteriai. (F), RRBS rezultatų, gautų iš BEF ir BiPS ląstelių, tankio diagrama. PCC, Pearsono koreliacijos koeficientas. (G) Histono 3 metilinimo būsenos sklaidos diagramos esant K4 (aktyvuojantis chromatino modifikavimas) arba K27 (represinis chromatino modifikavimas) po ChIP-seq iš BEF arba BiPS ląstelių, kaip nurodyta. (H) H3K4me3 ir H3K27me3 sklaidos grafikas BiPS ląstelėse, iliustruojantis dvivalenčių chromatino vietų buvimą BiPS ląstelėse. (I) RNA-seq, ATAC-seq ir H3K4me3 arba H3K27me3 ChIP-seq signalai pasirinktų genų, turinčių žinomus vaidmenis perprogramuojant, kurie yra aktyvuojami (Nanog, Kit) arba represuojami (Thy1) BiPS, palyginti su BEF ląstelėmis.

Modifikuoto perprogramavimo metodo poveikis šikšnosparnių epigenetinėms molekulėms ir chromatinui buvo įvertintas naudojant transpozazei prieinamą chromatiną su sekos nustatymu (ATAC-seq). Taip pat buvo atlikta dezoksiribonukleino rūgšties (DNR) metilomų kartografavimo analizė ir chromatino imunoprecipitacijos ir sekos nustatymo (ChIP-seq) analizė. Protokolai buvo optimizuoti, kad būtų galima SC diferencijuoti šikšnosparnius į tris gemalo sluoksnius, o embriono kūno (EB) diferenciacijos tyrimas buvo atliktas siekiant įvertinti pluripotenciją.

Tada šikšnosparnių iPSC (BiPSC) buvo sušvirkšti į imunosupresuotas peles, o iš BiPSC buvo sukurtos embrioninės struktūros. Tyrimo protokolas buvo patvirtintas sukuriant BiPS ląsteles iš evoliuciškai tolimo šikšnosparnio Myotis myotis.

Lyginamasis transkripcijos genų profiliavimas ir pagrindinių komponentų analizė (PCA) buvo atlikta šikšnosparnių rūšims Rhinolophus ir filogenetiškai įvairioms žinduolių rūšims, pelėms, žmonėms, šunims, kiaulėms ir marmozetėms.

Genų ontologijos analizė buvo atlikta siekiant įvertinti naujausią genų praturtėjimą specifiniams biologiniams takams. Buvo sukurti nauji vamzdynai, pagrįsti metagenomine kamieninių ląstelių ribonukleino rūgšties (RNR) sekos (RNR sekų) duomenų klasifikacija, de novo numanomu retroviruso kontigų surinkimu ir genomo kartografavimu, siekiant nustatyti bona fide retrovirusinius rodmenis. Be to, buvo ištirti antigenų žymenys, susiję su RNR virusais.

Studijų rezultatai

Konkretus perprogramavimo faktoriaus santykis, taip pat fibroblastų augimo faktoriaus-2 (Fgf-2), kamieninių ląstelių faktoriaus (Scf), leukemiją slopinančio faktoriaus (Lif) ir forskolino pridėjimas prie auginimo terpės leido neslopinamam BiPSC augimui, o homogeniškos ir tankios šikšnosparnių kolonijos atsirado per 14–16 dienų.

BiPSC išreiškė Oct4 pluripotencijos faktorių proliferacijos greičiu, identišku žmogaus PSC proliferacijos greičiui. Daugumoje ląstelių buvo 56 chromosomos ir jos dauginosi be egzogeninių perprogramavimo veiksnių ir morfologinių pokyčių.

BiPSC išsiskyrė į tris gemalo sluoksnius ir vėliau suformavo EB ir organoidus. RNR-seq analizė parodė sukeltą kanoninių su pluripotencija susijusių genų, tokių kaip SRY-2, Nanog ir Oct4, endogeninę ekspresiją.

Tačiau genetinis profilis visiškai neatitiko pluripotencijos būsenos. Vietoj to buvo išreikšti naivūs pluripotentinės būsenos veiksniai, tokie kaip Klf4 ir 17, su estrogenais susijęs receptoriaus beta baltymas (Essrb), transkripcijos faktorius E3 (Tfe3) ir transkripcijos faktorius CP2 Like 1 (Tfcp2l1). Buvo pastebėtas kartu išreikštas Tfcp2l1 / cinko piršto baltymas (Zic2) ir Orthodenticle Homeobox 2 (Otx2) / Tfe3, taip pat pradiniai / naivūs veiksniai.

Chromatino konfigūracijos ir CpG 191 metilinimo pokyčiai buvo pastebėti visame šikšnosparnio genome. ChiP-seq rezultatai parodė, kad žmogaus ir šikšnosparnio dvivalentės genai sutampa, nors kai kurie genai buvo specifiniai rūšiai.

BiPSC buvo perprogramuoti transkripciniu ir epigenetiniu būdu. BIPSC buvo teigiami dėl suporuotų dėžutės baltymų (Pax6), 213T ir alfa-fetoproteino (AFP) žymenų ektodermai, mezodermai ir endodermai.

ERAS genas buvo sumažintas, o hialuronidazių ir ADP-ribosilinimo faktorių (ARF) genai buvo neatskiriami tarp grupių. Rhinolophus blastoidai parodė embrionines struktūras, susietas su plokščiu trofoblastiniu epitelio atauga ir vidine ląstelių masės plėtra. Myotis šikšnosparnių rezultatai rodo, kad tyrimo protokolas gali būti taikomas skirtingoms šikšnosparnių rūšims.

PCA analizė atskleidė atskirą šikšnosparnių kamieninių ląstelių grupę. Tačiau tik aštuoni pagrindiniai genai parodė reikšmingą teigiamą R. ferrumequinum atranką, dauguma genų priklausė netikėtoms kategorijoms. Be to, CoV liga buvo labiausiai išplėsta kategorija Kioto genų ir genomų enciklopedijoje (KEGG).

BiPSC buvo aptikti III tipo kolageno alfa 1 (Col3a1) ir mucino 1 (Muc1) genai, o tai rodo šikšnosparniams būdingas genetines adaptacijas. Perprogramavimas atskleidė endogeninių retrovirusų (ERV) sekas.

BiPSC buvo daug su virusu susijusių endogenizuotų sekų su regionais, homologiškais žmogaus herpesvirusui 4, žmogaus kvėpavimo sincitiniam virusui ir SARS-CoV-2 izoliatui. R. ferrumequinum genominės sekos buvo panašios į žmogaus CoV 229E ir žmogaus CoV OC43 sekas.

Buvo nustatytos kelios retrovirusinės integracijos vietos, kurios buvo homologiškos virusams, tokiems kaip Mason-Pfizer beždžionių virusas, koala virusas ir Jaagsiekte avies retrovirusas. Genomas buvo homologiškas pelėpų, vėjaraupių, voverės raupų, beždžionių raupų ir baltųjų raupų sindromo virusams.

Išvados

BiPSC sekos buvo panašios į viruso genomo sekas. Taigi, šikšnosparnių transkripcijos leistina pluripotencijos būsena gali būti išnaudota siekiant atrasti naujas šikšnosparnių virusų sekas, susijusias su šikšnosparnių fiziologija ir jų viruso šeimininko gebėjimais.

Šis naujienų straipsnis buvo išankstinės mokslinės ataskaitos, kuri publikavimo metu nebuvo recenzuota, apžvalga. Nuo pat pirminio paskelbimo mokslinė ataskaita buvo recenzuojama ir priimta publikuoti akademiniame žurnale. Nuorodos į preliminarias ir recenzuotas ataskaitas rasite skiltyje Šaltiniai šio straipsnio pabaigoje. Žiūrėti šaltinius

Nuorodos:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Dejosez, M., Marin, A., Hughes, GM, et al. (2022). Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren einzigartige Verflechtung zwischen Wirt und Viren. bioRxiv. doi:10.1101/2022.09.23.509261. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.23.509261v1.
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Déjosez, Marion, Arturo Marin, Graham M. Hughes, Ariadna E. Morales, Carlos Godoy-Parejo, Jonathan L. Gray, Yiren Qin, et al. 2023. „Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren ungewöhnliche Verflechtung zwischen Wirt und Viren.“ Zelle 186 (5): 957-974.e28. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.01.011. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867423000417.

Straipsnių pataisymai

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.