Pluripotentas sikspārņu cilmes šūnas kā modelis jaunu vīrusu izpētei

Pluripotentas sikspārņu cilmes šūnas kā modelis jaunu vīrusu izpētei

Sikspārņi ir attīstījušies ar tādām unikālām iezīmēm kā balsenes atbalss un lidojums, un daži spēj panest vīrusus, piemēram, smagus akūtu respiratorā sindroma koronavīrusus (SARS-CoV), Tuvo Austrumu respiratorā sindroma CoV (MERS-CoV) un Marburgas un Nipah vīrusus. Spēcīgu uz šūnām balstītu sikspārņu modeļu izstrāde varētu palīdzēt labāk izprast sikspārņu vīrusu pārvaldību un to bioloģiju.

Nesen publicētā pētījumā par šo tēmu bioRxiv * Priekšdrukas serveris: pētnieki ģenerēja inducētas pluripotentas cilmes šūnas (iPSC) no Rhinolophus ferrumequinum sikspārņiem, izmantojot modificēto Yamanaka protokolu, lai izveidotu sikspārņus kā jaunu in vivo modeļa pētījumu sugu.

Pētījums: Sikspārņu pluripotentās cilmes šūnas atklāj unikālu saimnieka un vīrusa savstarpējo savienojumu.Fotoattēlu kredīts: Jezper / Shutterstock.com

Šis ziņu raksts bija pārskats par sākotnējo zinātnisko ziņojumu, kas publicēšanas laikā nebija recenzēts. Kopš sākotnējās publicēšanas zinātniskais ziņojums tagad ir recenzēts un pieņemts publicēšanai akadēmiskajā žurnālā. Saites uz provizoriskajiem un salīdzinošajiem pārskatiem ir atrodamas sadaļā Avoti šī raksta beigās. Skatīt avotus

Par pētījumu

Šajā pētījumā pētnieki pēta, vai sikspārņi varētu būt piemēroti vīrusu ražošanai.

Yamanaka pārprogrammēšanas pieeja tika izmantota, pamatojoties uz pārprogrammēšanas faktoriem, piemēram, dzimumu noteicošo reģionu Y-box-2 gēnu, oktamēru saistošo transkripcijas faktoru 4 (Oct4), cMyc un Kruppel līdzīgu faktoru 4 (Klf4).

Sikspārņu embrionālās fibroblastu (BEF) šūnas tika izolētas no R. ferrumequinum, mainot pārprogrammēšanas faktoru līmeni, lai aktivizētu un bloķētu vairākus signalizācijas ceļus. Turklāt tika veiktas arī imūnās krāsošanas un ribonukleīnskābes (RNS) sekvencēšanas (RNS-seq) analīzes.

Pluripotentu sikspārņu cilmes šūnu iegūšana. (A) Pluripotentu sikspārņu cilmes šūnu iegūšanas stratēģijas ilustrācija. BEF, embrionālie fibroblasti; OSMK, Oct4, Sox2, cMyc, Klf4; FB, fibroblastu barotne; PSC, pluripotenta cilmes šūnu barotne; PSC+, PSC ar piedevām. (B) Izveidoto BiPS šūnu koloniju morfoloģija, kas audzēta uz peles embriju fibroblastiem. (C) Oct4 imunofluorescences noteikšana BiPS šūnās. (D) RNS-seq datu MA diagramma, kas ilustrē transkripcijas atšķirības starp sikspārņu embrionālajiem fibroblastiem (BEF) un pluripotentajām cilmes šūnām (BiPS). Tiek izcelti atlasītie gēni ar zināmām funkcijām pluripotences noteikšanā vai uzturēšanā. (E) Kmean klasteru analīze ATAC-seq signāliem, kas iegūti no BEF vai BiPS šūnām. C, kopas. (F), RRBS rezultātu blīvuma diagramma, kas iegūta no BEF un BiPS šūnām. PCC, Pīrsona korelācijas koeficients. (G) Histona 3 metilēšanas statusa izkliedes diagrammas pie K4 (aktivizējoša hromatīna modifikācija) vai K27 (represīvā hromatīna modifikācija) pēc ChIP-seq no BEF vai BiPS šūnām, kā norādīts. (H) H3K4me3 un H3K27me3 izkliedes diagramma BiPS šūnās, kas ilustrē divvērtīgo hromatīna vietu klātbūtni BiPS šūnās. (I) RNS-seq, ATAC-seq un H3K4me3 vai H3K27me3 ChIP-seq signāli atlasītajiem gēniem ar zināmām lomām pārprogrammēšanā, kas tiek aktivizēti (Nanog, Kit) vai represēti (Thy1) BiPS, salīdzinot ar BEF šūnām.

Modificētās pārprogrammēšanas metodes ietekme uz sikspārņu epiģenētiskajām molekulām un hromatīnu tika novērtēta, izmantojot transpozāzes pieejamo hromatīnu ar sekvencēšanas (ATAC-seq) testu. Tika veiktas arī dezoksiribonukleīnskābes (DNS) metilomu kartēšanas analīzes un hromatīna imunoprecipitācijas un sekvencēšanas (ChIP-seq) analīzes. Protokoli tika optimizēti, lai nodrošinātu sikspārņu SC diferenciāciju trīs dīgļu slāņos, savukārt embrija ķermeņa (EB) diferenciācijas tests tika veikts, lai novērtētu pluripotenci.

Pēc tam sikspārņu iPSC (BiPSC) tika injicēti pelēm ar nomāktu imūnsistēmu, un no BiPSC tika izveidotas embrionālās struktūras. Pētījuma protokols tika apstiprināts, izstrādājot BiPS šūnas no evolucionāri attālā sikspārņa Myotis myotis.

Salīdzinošā transkripcijas gēnu profilēšana un galveno komponentu analīzes (PCA) tika veiktas sikspārņu sugām Rhinolophus un filoģenētiski daudzveidīgām zīdītāju sugām – pelēm, cilvēkiem, suņiem, cūkām un marmozetēm.

Gēnu ontoloģijas analīze tika veikta, lai novērtētu jaunāko gēnu bagātināšanu specifiskiem bioloģiskiem ceļiem. Ir izstrādāti jauni cauruļvadi, pamatojoties uz cilmes šūnu ribonukleīnskābes (RNS) sekvencētu (RNS-seq) datu metagenomisko klasifikāciju, de novo iespējamo retrovīrusu kontigāciju komplektu un genoma kartēšanu, lai identificētu bona fide retrovīrusu nolasījumus. Turklāt tika pārbaudīti antigēnu marķieri, kas saistīti ar RNS vīrusiem.

Studiju rezultāti

Īpaša pārprogrammēšanas faktoru attiecība, kā arī fibroblastu augšanas faktora-2 (Fgf-2), cilmes šūnu faktora (Scf), leikēmiju inhibējošā faktora (Lif) un forskolīna pievienošana barotnei nodrošināja neinhibētu BiPSC augšanu, un 14–16 dienu laikā parādījās viendabīgas un blīvas sikspārņu kolonijas.

BiPSC izteica Oct4 pluripotences faktoru ar proliferācijas ātrumu, kas ir identisks cilvēka PSC proliferācijas ātrumam. Lielākajā daļā šūnu bija 56 hromosomas un tās atkārtojās bez eksogēniem pārprogrammēšanas faktoriem un morfoloģiskām izmaiņām.

BiPSC diferencējās trīs dīgļu slāņos un pēc tam veidoja EB un organoīdus. RNS-seq analīze parādīja kanonisko pluripotenci saistītu gēnu, piemēram, SRY-2, Nanog un Oct4, izraisītu endogēnu ekspresiju.

Tomēr ģenētiskais profils pilnībā neatbilda pluripotences stāvoklim. Tā vietā tika izteikti naivi pluripotentā stāvokļa faktori, piemēram, Klf4 un 17, ar estrogēnu saistīts beta receptoru proteīns (Essrb), transkripcijas faktors E3 (Tfe3) un transkripcijas faktors CP2 Like 1 (Tfcp2l1). Tika novērots koekspresēts Tfcp2l1/cinka pirkstu proteīns (Zic2) un Orthodenticle Homeobox 2 (Otx2)/Tfe3, kā arī sākotnējie/naivie faktori.

Izmaiņas hromatīna konfigurācijā un CpG 191 metilācijā tika novērotas visā sikspārņa genomā. ChiP-seq rezultāti parādīja pārklāšanos starp cilvēka un sikspārņu bivalences gēniem, lai gan daži gēni bija specifiski sugai.

BiPSC tika transkripcijas un epiģenētiski pārprogrammēti. BIPSC bija pozitīvi attiecībā uz pāru kastes proteīna (Pax6), 213T un alfa-fetoproteīna (AFP) marķieriem ektodermai, mezodermai un endodermai.

ERAS gēns tika samazināts, savukārt hialuronidāžu un ADP-ribosilācijas faktoru (ARF) gēni nebija atšķirami starp grupām. Rhinolophus blastoīdi parādīja embriju struktūras, kas saistītas ar saplacinātu trofoblastisku epitēlija izaugumu un iekšējo šūnu masas izplešanos. Myotis sikspārņu rezultāti liecināja, ka pētījuma protokolu var piemērot dažādām sikspārņu sugām.

PCA analīze atklāja atšķirīgu sikspārņu cilmes šūnu grupu. Tomēr tikai astoņi galvenie gēni uzrādīja nozīmīgu pozitīvu R. ferrumequinum atlasi, un lielākā daļa gēnu pieder neparedzētām kategorijām. Turklāt CoV slimība bija visnozīmīgākā kategorija Kioto gēnu un genomu enciklopēdijā (KEGG).

BiPSC tika atklāti III tipa kolagēna alfa 1 (Col3a1) un mucīna 1 (Muc1) gēni, kas norāda uz sikspārņiem specifiskām ģenētiskām adaptācijām. Pārprogrammēšana atklāja endogēno retrovīrusu (ERV) sekvences.

BiPSC saturēja vairākas ar vīrusu saistītas endogenizētas sekvences ar reģioniem, kas bija homologi cilvēka herpesvīrusam 4, cilvēka elpceļu sincitiālajam vīrusam un SARS-CoV-2 izolātam. R. ferrumequinum genoma secības bija līdzīgas cilvēka CoV 229E un cilvēka CoV OC43 sekvencēm.

Tika identificētas vairākas retrovīrusu integrācijas vietas, kas bija homologas tādiem vīrusiem kā Mason-Pfizer pērtiķu vīruss, koalas vīruss un Jaagsiektes aitas retrovīruss. Genoms bija homologs baloku, vējbaku, vāverbaku, pērtiķu un balto baku sindroma vīrusiem.

Secinājumi

BiPSC sekvences bija līdzīgas vīrusa genoma sekvencēm. Tādējādi sikspārņu transkripcijas pieļaujamo pluripotences stāvokli varētu izmantot, lai atklātu jaunas sikspārņu vīrusu sekvences, kas saistītas ar sikspārņu fizioloģiju un to vīrusu mitināšanas spējām.

Šis ziņu raksts bija pārskats par sākotnējo zinātnisko ziņojumu, kas publicēšanas laikā nebija recenzēts. Kopš sākotnējās publicēšanas zinātniskais ziņojums tagad ir recenzēts un pieņemts publicēšanai akadēmiskajā žurnālā. Saites uz provizoriskajiem un salīdzinošajiem pārskatiem ir atrodamas sadaļā Avoti šī raksta beigās. Skatīt avotus

Atsauces:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Dejosez, M., Marin, A., Hughes, GM, et al. (2022). Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren einzigartige Verflechtung zwischen Wirt und Viren. bioRxiv. doi:10.1101/2022.09.23.509261. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.23.509261v1.
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Déjosez, Marion, Arturo Marin, Graham M. Hughes, Ariadna E. Morales, Carlos Godoy-Parejo, Jonathan L. Gray, Yiren Qin, et al. 2023. „Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren ungewöhnliche Verflechtung zwischen Wirt und Viren.“ Zelle 186 (5): 957-974.e28. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.01.011. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867423000417.

Rakstu labojumi

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.