Pluripotente vleermuisstamcellen als model voor het bestuderen van nieuwe virussen

Pluripotente vleermuisstamcellen als model voor het bestuderen van nieuwe virussen

Vleermuizen zijn geëvolueerd met unieke kenmerken zoals laryngeale echolocatie en vlucht, waarbij sommige virussen kunnen verdragen zoals ernstige acute respiratoire syndroom-coronavirussen (SARS-CoV's), CoV's van het Midden-Oosten respiratoir syndroom (MERS-CoV's) en Marburg- en Nipah-virussen. De ontwikkeling van robuuste celgebaseerde vleermuismodellen zou kunnen leiden tot een beter begrip van het beheer van vleermuizenvirussen en hun biologie.

In een onlangs gepubliceerde studie over dit onderwerp bioRxiv * Preprint-server: onderzoekers genereerden geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) van Rhinolophus ferrumequinum-vleermuizen met behulp van het aangepaste Yamanaka-protocol om vleermuizen te vestigen als een nieuwe in vivo modelstudiesoort.

Studie: Pluripotente stamcellen van vleermuizen onthullen een unieke interactie tussen gastheer en virusFotocredit: Jezper / Shutterstock.com

Dit nieuwsartikel was een recensie van een voorlopig wetenschappelijk rapport dat op het moment van publicatie nog niet door vakgenoten was beoordeeld. Sinds de eerste publicatie is het wetenschappelijk rapport nu peer-reviewed en geaccepteerd voor publicatie in een academisch tijdschrift. Links naar de voorlopige en peer-reviewed rapporten zijn te vinden in de sectie Bronnen aan het einde van dit artikel. Bekijk bronnen

Over de studie

In het huidige onderzoek onderzoeken onderzoekers of vleermuizen geschikt kunnen zijn voor virusproductie.

De Yamanaka-herprogrammeringsaanpak werd gebruikt op basis van herprogrammeringsfactoren zoals het geslachtsbepalende gebied Y-box-2-gen, octameerbindende transcriptiefactor 4 (Oct4), cMyc en Kruppel-achtige factor 4 (Klf4).

Vleermuisembryofibroblastcellen (BEF) werden geïsoleerd uit R. ferrumequinum, waarbij de niveaus van herprogrammeringsfactoren werden gewijzigd om meerdere signaalroutes te activeren en te blokkeren. Daarnaast werden ook immunokleuring en ribonucleïnezuur (RNA) sequencing (RNA-seq) analyses uitgevoerd.

Het verkrijgen van pluripotente vleermuisstamcellen. (A) Illustratie van de strategie voor het verkrijgen van pluripotente vleermuisstamcellen. BEF, embryonale fibroblasten; OSMK, Oct4, Sox2, cMyc, Klf4; FB, fibroblastmedium; PSC, pluripotent stamcelmedium; PSC+, PSC met additieven. (B) Morfologie van gevestigde BiPS-celkolonies gekweekt op embryonale fibroblasten van muizen. (C) Immunofluorescentiedetectie van Oct4 in BiPS-cellen. (D) MA-plot van RNA-seq-gegevens die de transcriptionele verschillen illustreren tussen vleermuisembryofibroblasten (BEF) en pluripotente stamcellen (BiPS). Geselecteerde genen met bekende functies bij het tot stand brengen of behouden van pluripotentie worden gemarkeerd. (E) Kmean-clusteranalyse van ATAC-seq-signalen verkregen uit BEF- of BiPS-cellen. C, clusters. (F), Dichtheidsplot van RRBS-resultaten verkregen uit BEF- en BiPS-cellen. PCC, Pearson-correlatiecoëfficiënt. (G) Scatterplots van histon 3-methylatiestatus op K4 (activerende chromatinemodificatie) of K27 (repressieve chromatinemodificatie) na ChIP-seq van BEF- of BiPS-cellen, zoals aangegeven. (H) Spreidingsdiagram van H3K4me3 en H3K27me3 in BiPS-cellen die de aanwezigheid van bivalente chromatineplaatsen in BiPS-cellen illustreert. (I) RNA-seq-, ATAC-seq- en H3K4me3- of H3K27me3 ChIP-seq-signalen van geselecteerde genen met bekende rollen bij herprogrammering die worden geactiveerd (Nanog, Kit) of onderdrukt (Thy1) in BiPS vergeleken met BEF-cellen.

De effecten van de gewijzigde herprogrammeringsmethode op epigenetische moleculen en chromatine van vleermuizen werden beoordeeld met behulp van de transposase-toegankelijke chromatine met sequencing (ATAC-seq) -test. Deoxyribonucleïnezuur (DNA) methylome mapping-analyses en chromatine-immunoprecipitatie en sequencing (ChIP-seq) analyses werden ook uitgevoerd. Protocollen werden geoptimaliseerd om SC-differentiatie van vleermuizen in de drie kiemlagen mogelijk te maken, terwijl differentiatietest van het embryoïde lichaam (EB) werd uitgevoerd om de pluripotentie te beoordelen.

Bat iPSC's (BiPSC's) werden vervolgens geïnjecteerd in immuunonderdrukte muizen en op basis van de BiPSC's werden embryonale structuren gecreëerd. Het onderzoeksprotocol werd gevalideerd door BiPS-cellen te ontwikkelen van de evolutionair verre vleermuis Myotis myotis.

Vergelijkende transcriptionele genprofilering en hoofdcomponentanalyses (PCA) werden uitgevoerd bij de vleermuissoort Rhinolophus en fylogenetisch diverse zoogdiersoorten muizen, mensen, honden, varkens en zijdeaapjes.

Genontologieanalyse werd uitgevoerd om de modernste genverrijking voor specifieke biologische routes te beoordelen. Er zijn nieuwe pijplijnen ontwikkeld op basis van metagenomische classificatie van stamcelribonucleïnezuur (RNA)-gesequenced (RNA-seq) gegevens, de novo vermeende retrovirale contig-assemblage en genomische mapping om bonafide retrovirale metingen te identificeren. Bovendien werden antigeenmarkers geassocieerd met RNA-virussen onderzocht.

Studieresultaten

Een specifieke herprogrammeringsfactorverhouding en de toevoeging van fibroblastgroeifactor-2 (Fgf-2), stamcelfactor (Scf), leukemie-remmende factor (Lif) en forskoline aan het kweekmedium maakten ongeremde BiPSC-groei mogelijk, waarbij homogene en dichte vleermuiskolonies binnen 14 tot 16 dagen verschenen.

BiPSC's brachten de Oct4-pluripotentiefactor tot expressie met een proliferatiesnelheid die identiek is aan de proliferatiesnelheid van menselijke PSC's. De meeste cellen bevatten 56 chromosomen en werden gerepliceerd zonder exogene herprogrammeringsfactoren en morfologische veranderingen.

BiPSC's differentieerden zich in de drie kiemlagen en vormden vervolgens EB's en organoïden. RNA-seq-analyse toonde geïnduceerde endogene expressie aan van canonieke pluripotentie-gerelateerde genen zoals SRY-2, Nanog en Oct4.

Het genetische profiel was echter niet volledig consistent met een pluripotentietoestand. In plaats daarvan werden naïeve pluripotente toestandsfactoren zoals Klf4 en 17, oestrogeengerelateerd receptor-bèta-eiwit (Essrb), transcriptiefactor E3 (Tfe3) en transcriptiefactor CP2 Like 1 (Tfcp2l1) tot expressie gebracht. Er werden gelijktijdig tot expressie gebracht Tfcp2l1/zinkvingereiwit (Zic2) en Orthodentic Homeobox 2 (Otx2)/Tfe3 evenals geprimede/naïeve factoren waargenomen.

Veranderingen in de chromatineconfiguratie en CpG 191-methylering werden overal in het vleermuisgenoom waargenomen. ChiP-seq-resultaten toonden overlap aan tussen bivalentiegenen van mens en vleermuis, hoewel sommige genen soortspecifiek waren.

BiPSC's werden transcriptioneel en epigenetisch geherprogrammeerd. BIPSC's waren positief voor paired box-eiwit (Pax6), 213T en alfa-fetoproteïne (AFP) markers voor ectoderm, mesoderm en endoderm.

Het ERAS-gen was gedownreguleerd, terwijl de genen voor hyaluronidasen en ADP-ribosylatiefactoren (ARF's) niet van elkaar te onderscheiden waren tussen de groepen. De Rhinolophus-blastoïden vertoonden embryonale structuren gebonden aan een afgeplatte trofoblastische epitheliale uitgroei en interne celmassa-expansie. De Myotis-vleermuisresultaten suggereerden dat het onderzoeksprotocol op verschillende vleermuissoorten zou kunnen worden toegepast.

PCA-analyse onthulde een aparte groep vleermuisstamcellen. Slechts acht topgenen vertoonden echter een significante positieve selectie in R. ferrumequinum, waarbij de meeste genen tot onverwachte categorieën behoorden. Bovendien was CoV-ziekte de meest uitgebreide categorie in de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).

De collageen type III alfa 1 (Col3a1) en mucine 1 (Muc1) genen werden gedetecteerd in BiPSC's, wat duidt op vleermuisspecifieke genetische aanpassingen. De herprogrammering bracht endogene retrovirus (ERV) sequenties aan het licht.

BiPSC's bevatten meerdere virusgeassocieerde endogeniseerde sequenties met gebieden die homoloog zijn aan het menselijke herpesvirus 4, het menselijke respiratoire syncytiële virus en een SARS-CoV-2-isolaat. De genomische sequenties van R. ferrumequinum waren vergelijkbaar met die van menselijk CoV 229E en menselijk CoV OC43.

Er werden verschillende retrovirale integratieplaatsen geïdentificeerd die homoloog waren aan virussen zoals het Mason-Pfizer-apenvirus, het koalavirus en het Jaagsiekte-schapenretrovirus. Het genoom was homoloog aan volepox-, variola-, eekhoornpokken-, apenpokken- en wittepokkenvirussen.

Conclusies

BiPSC-sequenties waren vergelijkbaar met virale genoomsequenties. De transcriptioneel permissieve pluripotentietoestand van vleermuizen zou dus kunnen worden benut om nieuwe vleermuisvirussequenties te ontdekken die betrokken zijn bij de vleermuisfysiologie en hun virus-hostende capaciteiten.

Dit nieuwsartikel was een recensie van een voorlopig wetenschappelijk rapport dat op het moment van publicatie nog niet door vakgenoten was beoordeeld. Sinds de eerste publicatie is het wetenschappelijk rapport nu peer-reviewed en geaccepteerd voor publicatie in een academisch tijdschrift. Links naar de voorlopige en peer-reviewed rapporten zijn te vinden in de sectie Bronnen aan het einde van dit artikel. Bekijk bronnen

Referenties:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Dejosez, M., Marin, A., Hughes, GM, et al. (2022). Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren einzigartige Verflechtung zwischen Wirt und Viren. bioRxiv. doi:10.1101/2022.09.23.509261. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.23.509261v1.
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Déjosez, Marion, Arturo Marin, Graham M. Hughes, Ariadna E. Morales, Carlos Godoy-Parejo, Jonathan L. Gray, Yiren Qin, et al. 2023. „Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren ungewöhnliche Verflechtung zwischen Wirt und Viren.“ Zelle 186 (5): 957-974.e28. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.01.011. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867423000417.

Artikelrevisies

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.