Pluripotente flaggermusstamceller som en modell for å studere nye virus

Pluripotente flaggermusstamceller som en modell for å studere nye virus

Flaggermus har utviklet seg med unike egenskaper som laryngeal ekkolokalisering og flukt, med noen i stand til å tolerere virus som alvorlige akutte respiratoriske syndrom-koronavirus (SARS-CoVs), Midtøsten respiratoriske syndrom CoVs (MERS-CoVs) og Marburg- og Nipah-virus. Utviklingen av robuste cellebaserte flaggermusmodeller kan føre til en bedre forståelse av håndtering av flaggermusvirus og deres biologi.

I en nylig publisert studie om emnet bioRxiv * Preprint-server: Forskere genererte induserte pluripotente stamceller (iPSCs) fra Rhinolophus ferrumequinum flaggermus ved å bruke den modifiserte Yamanaka-protokollen for å etablere flaggermus som en ny in vivo modellstudieart.

Studere: Flaggermus-pluripotente stamceller avslører unik vert-virus-sammenkobling.Bildekreditt: Jezper / Shutterstock.com

Denne nyhetsartikkelen var en gjennomgang av en foreløpig vitenskapelig rapport som ikke hadde blitt fagfellevurdert på publiseringstidspunktet. Siden den første publiseringen har den vitenskapelige rapporten nå blitt fagfellevurdert og akseptert for publisering i et akademisk tidsskrift. Lenker til de foreløpige og fagfellevurderte rapportene finner du i Kilder-delen på slutten av denne artikkelen. Se kilder

Om studiet

I denne studien undersøker forskere om flaggermus kan være egnet for virusproduksjon.

Yamanaka-reprogrammeringstilnærmingen ble brukt basert på omprogrammeringsfaktorer som det kjønnsbestemmende området Y-box-2-genet, oktamerbindende transkripsjonsfaktor 4 (okt4), cMyc og Kruppel-lignende faktor 4 (Klf4).

Embryonale fibroblastceller fra flaggermus (BEF) ble isolert fra R. ferrumequinum med nivåer av omprogrammeringsfaktorer endret for å aktivere og blokkere flere signalveier. I tillegg ble det også utført analyser av immunfarging og ribonukleinsyre (RNA) (RNA-seq).

Innhenting av pluripotente flaggermusstamceller. (A) Illustrasjon av strategien for å oppnå pluripotente flaggermusstamceller. BEF, embryonale fibroblaster; OSMK, okt4, Sox2, cMyc, Klf4; FB, fibroblastmedium; PSC, pluripotent stamcellemedium; PSC+, PSC med tilsetningsstoffer. (B) Morfologi av etablerte BiPS-cellekolonier dyrket på embryonale fibroblaster fra mus. (C) Immunfluorescensdeteksjon av Oct4 i BiPS-celler. (D) MA-plott av RNA-seq-data som illustrerer transkripsjonelle forskjeller mellom flaggermus-embryonale fibroblaster (BEF) og pluripotente stamceller (BiPS). Utvalgte gener med kjente funksjoner for å etablere eller opprettholde pluripotens er uthevet. (E) Kmean klyngeanalyse av ATAC-seq-signaler hentet fra BEF- eller BiPS-celler. C, klynger. (F), Tetthetsplott av RRBS-resultater hentet fra BEF- og BiPS-celler. PCC, Pearson korrelasjonskoeffisient. (G) Scatterplots av histon 3-metyleringsstatus ved K4 (aktiverende kromatinmodifikasjon) eller K27 (repressiv kromatinmodifikasjon) etter ChIP-seq fra BEF- eller BiPS-celler, som angitt. (H) Spredningsplott av H3K4me3 og H3K27me3 i BiPS-celler som illustrerer tilstedeværelsen av bivalente kromatinsteder i BiPS-celler. (I) RNA-seq, ATAC-seq og H3K4me3 eller H3K27me3 ChIP-seq signaler av utvalgte gener med kjente roller i omprogrammering som er aktivert (Nanog, Kit) eller undertrykt (Thy1) i BiPS sammenlignet med BEF-celler.

Effektene av den modifiserte omprogrammeringsmetoden på flaggermus epigenetiske molekyler og kromatin ble vurdert ved å bruke den transposase-tilgjengelige kromatin med sekvensering (ATAC-seq) analysen. Deoksyribonukleinsyre (DNA) metylomkartleggingsanalyser og kromatinimmunutfellings- og sekvenseringsanalyser (ChIP-seq) ble også utført. Protokoller ble optimalisert for å tillate SC-differensiering av flaggermus inn i de tre kimlagene, mens embryoid kropps (EB) differensieringsanalyse ble utført for å vurdere pluripotens.

Bat iPSCs (BiPSCs) ble deretter injisert i immunsupprimerte mus og embryonale strukturer ble opprettet fra BiPSCs. Studieprotokollen ble validert ved å utvikle BiPS-celler fra den evolusjonært fjerne flaggermusen Myotis myotis.

Sammenlignende transkripsjonell genprofilering og hovedkomponentanalyser (PCA) ble utført i flaggermus-arten Rhinolophus og fylogenetisk forskjellige pattedyrarter av mus, mennesker, hunder, griser og silkeabber.

Genontologianalyse ble utført for å vurdere den nyeste genanrikningen for spesifikke biologiske veier. Nye rørledninger er utviklet basert på metagenomisk klassifisering av stamcelle-ribonukleinsyre (RNA)-sekvenserte (RNA-seq) data, de novo antatt retroviral contig-montering og genomisk kartlegging for å identifisere bona fide retrovirale lesninger. I tillegg ble antigenmarkører assosiert med RNA-virus undersøkt.

Studieresultater

Et spesifikt reprogrammeringsfaktorforhold samt tilsetning av fibroblastvekstfaktor-2 (Fgf-2), stamcellefaktor (Scf), leukemihemmende faktor (Lif) og forskolin til kulturmediet muliggjorde uhemmet BiPSC-vekst, med homogene og tette flaggermuskolonier som dukket opp innen 14 til 16 dager.

BiPSCs uttrykte Oct4 pluripotensfaktor med en spredningshastighet identisk med spredningshastigheten til humane PSCer. De fleste celler inneholdt 56 kromosomer og replikerte uten eksogene omprogrammeringsfaktorer og morfologiske endringer.

BiPSCs differensierte seg til de tre kimlagene og dannet deretter EB-er og organoider. RNA-seq-analyse viste indusert endogen ekspresjon av kanoniske pluripotensrelaterte gener som SRY-2, Nanog og Oct4.

Imidlertid var den genetiske profilen ikke helt i samsvar med en pluripotenstilstand. I stedet ble naive pluripotente tilstandsfaktorer som Klf4 og 17, østrogenrelatert reseptor betaprotein (Essrb), transkripsjonsfaktor E3 (Tfe3) og transkripsjonsfaktor CP2 Like 1 (Tfcp2l1) uttrykt. Samuttrykt Tfcp2l1/sinkfingerprotein (Zic2) og Orthodenticle Homeobox 2 (Otx2)/Tfe3 samt primede/naive faktorer ble observert.

Endringer i kromatinkonfigurasjon og CpG 191-metylering ble observert gjennom flaggermusgenomet. ChiP-seq-resultater viste overlapp mellom menneskelige og flaggermus-bivalensgener, selv om noen gener var artsspesifikke.

BiPSCs ble transkripsjonelt og epigenetisk omprogrammert. BIPSC-er var positive for paret boksprotein (Pax6), 213T og alfa-fetoprotein (AFP) markører for ektoderm, mesoderm og endoderm.

ERAS-genet ble nedregulert, mens genene for hyaluronidaser og ADP-ribosyleringsfaktorer (ARF) ikke kunne skilles mellom grupper. Rhinolophus-blastoidene viste embryonale strukturer bundet til en flatet trofoblastisk epitelutvekst og intern cellemasseekspansjon. Myotis-flaggermusresultatene antydet at studieprotokollen kunne brukes på forskjellige flaggermusarter.

PCA-analyse avslørte en distinkt gruppe flaggermusstamceller. Imidlertid viste bare åtte toppgener signifikant positiv seleksjon i R. ferrumequinum, med de fleste gener som tilhørte uventede kategorier. Videre var CoV-sykdom den mest betydelig utvidede kategorien i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).

Kollagen type III alfa 1 (Col3a1) og mucin 1 (Muc1) gener ble påvist i BiPSCs, noe som indikerer flaggermusspesifikke genetiske tilpasninger. Omprogrammeringen avslørte endogene retrovirus (ERV) sekvenser.

BiPSCs inneholdt flere virusassosierte endogeniserte sekvenser med regioner homologe med humant herpesvirus 4, humant respiratorisk syncytialvirus og et SARS-CoV-2-isolat. De genomiske sekvensene til R. ferrumequinum var lik de til human CoV 229E og human CoV OC43.

Det ble identifisert flere retrovirale integrasjonssteder som var homologe med virus som Mason-Pfizer apevirus, koalavirus og Jaagsiekte saueretrovirus. Genomet var homologt med virus av volepox, variola, ekornkopper, monkeypox og whitepox syndrom.

Konklusjoner

BiPSC-sekvenser var lik virale genomsekvenser. Dermed kan den transkripsjonelt permissive pluripotenstilstanden til flaggermus utnyttes til å oppdage nye flaggermusvirussekvenser involvert i flaggermusfysiologi og deres evner som hosting av virus.

Denne nyhetsartikkelen var en gjennomgang av en foreløpig vitenskapelig rapport som ikke hadde blitt fagfellevurdert på publiseringstidspunktet. Siden den første publiseringen har den vitenskapelige rapporten nå blitt fagfellevurdert og akseptert for publisering i et akademisk tidsskrift. Lenker til de foreløpige og fagfellevurderte rapportene finner du i Kilder-delen på slutten av denne artikkelen. Se kilder

Referanser:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Dejosez, M., Marin, A., Hughes, GM, et al. (2022). Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren einzigartige Verflechtung zwischen Wirt und Viren. bioRxiv. doi:10.1101/2022.09.23.509261. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.23.509261v1.
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Déjosez, Marion, Arturo Marin, Graham M. Hughes, Ariadna E. Morales, Carlos Godoy-Parejo, Jonathan L. Gray, Yiren Qin, et al. 2023. „Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren ungewöhnliche Verflechtung zwischen Wirt und Viren.“ Zelle 186 (5): 957-974.e28. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.01.011. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867423000417.

Artikkelrevisjoner

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.