Pluripotencjalne komórki macierzyste nietoperzy jako model do badania nowych wirusów

Pluripotencjalne komórki macierzyste nietoperzy jako model do badania nowych wirusów

Nietoperze ewoluowały z unikalnymi cechami, takimi jak echolokacja krtani i lot, a niektóre są w stanie tolerować wirusy, takie jak koronawirusy ciężkiego ostrego zespołu oddechowego (SARS-CoV), bliskowschodni zespół oddechowy CoV (MERS-CoV) oraz wirusy Marburg i Nipah. Opracowanie solidnych, komórkowych modeli nietoperzy może doprowadzić do lepszego zrozumienia zarządzania wirusami nietoperzy i ich biologii.

W niedawno opublikowanym badaniu na ten temat bioRxiv * Serwer wydruku wstępnego: badacze wygenerowali indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) z nietoperzy Rhinolophus ferrumequinum, korzystając ze zmodyfikowanego protokołu Yamanaka, aby ustalić, że nietoperze są nowym gatunkiem do badań modelowych in vivo.

Badanie: Pluripotencjalne komórki macierzyste nietoperzy ujawniają unikalne połączenia między gospodarzem a wirusem.Źródło zdjęcia: Jezper / Shutterstock.com

Ten artykuł prasowy był recenzją wstępnego raportu naukowego, który nie był recenzowany w momencie publikacji. Od czasu pierwszej publikacji raport naukowy został poddany recenzji naukowej i zaakceptowany do publikacji w czasopiśmie akademickim. Linki do raportów wstępnych i recenzowanych można znaleźć w sekcji Źródła na końcu tego artykułu. Zobacz źródła

O badaniu

W niniejszym badaniu naukowcy sprawdzają, czy nietoperze mogą nadawać się do produkcji wirusów.

Zastosowano podejście do przeprogramowania Yamanaka w oparciu o czynniki przeprogramowania, takie jak gen Y-box-2 regionu determinującego płeć, czynnik transkrypcyjny 4 wiążący oktamer (Oct4), cMyc i czynnik podobny do Kruppela 4 (Klf4).

Z R. ferrumequinum wyizolowano embrionalne fibroblasty nietoperzy (BEF) ze zmienionymi poziomami czynników przeprogramowujących w celu aktywowania i blokowania wielu szlaków sygnałowych. Ponadto przeprowadzono również analizę immunobarwienia i sekwencjonowania kwasu rybonukleinowego (RNA) (RNA-seq).

Pozyskiwanie pluripotencjalnych komórek macierzystych nietoperzy. (A) Ilustracja strategii otrzymywania pluripotencjalnych komórek macierzystych nietoperzy. BEF, embrionalne fibroblasty; OSMK, Oct4, Sox2, cMyc, Klf4; FB, pożywka dla fibroblastów; PSC, pluripotencjalna pożywka z komórkami macierzystymi; PSC+, PSC z dodatkami. (B) Morfologia ustalonych kolonii komórek BiPS hodowanych na embrionalnych fibroblastach myszy. (C) Wykrywanie immunofluorescencyjne Oct4 w komórkach BiPS. (D) Wykres MA danych dotyczących sekwencji RNA ilustrujący różnice w transkrypcji między embrionalnymi fibroblastami nietoperzy (BEF) a pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi (BiPS). Podkreślono wybrane geny o znanych funkcjach w ustanawianiu lub utrzymywaniu pluripotencji. (E) Analiza skupień Kmean sygnałów ATAC-seq uzyskanych z komórek BEF lub BiPS. C, klastry. (F), Wykres gęstości wyników RRBS uzyskanych z komórek BEF i BiPS. PCC, współczynnik korelacji Pearsona. (G) Wykresy rozrzutu stanu metylacji histonu 3 w K4 (aktywująca modyfikacja chromatyny) lub K27 (represyjna modyfikacja chromatyny) po ChIP-seq z komórek BEF lub BiPS, jak wskazano. (H) Wykres punktowy H3K4me3 i H3K27me3 w komórkach BiPS ilustrujący obecność dwuwartościowych miejsc chromatyny w komórkach BiPS. (I) Sygnały RNA-seq, ATAC-seq i H3K4me3 lub H3K27me3 ChIP-seq wybranych genów o znanych rolach w przeprogramowaniu, które są aktywowane (Nanog, Kit) lub tłumione (Thy1) w BiPS w porównaniu z komórkami BEF.

Wpływ zmodyfikowanej metody przeprogramowania na cząsteczki epigenetyczne nietoperzy i chromatynę oceniano za pomocą testu sekwencjonowania chromatyny dostępnej dla transpozazy (ATAC-seq). Przeprowadzono także analizy mapowania metylomu kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) oraz analizy immunoprecypitacji i sekwencjonowania chromatyny (ChIP-seq). Protokoły zoptymalizowano, aby umożliwić różnicowanie SC nietoperzy do trzech listków zarodkowych, natomiast przeprowadzono test różnicowania ciałek embrionalnych (EB) w celu oceny pluripotencji.

Następnie wstrzyknięto komórki Bat iPSC (BiPSC) myszom z obniżoną odpornością i z BiPSC utworzono struktury embrionalne. Protokół badania potwierdzono poprzez opracowanie komórek BiPS z ewolucyjnie odległego nietoperza Myotis myotis.

Przeprowadzono porównawcze profilowanie genów transkrypcyjnych i analizy głównych składników (PCA) u gatunku nietoperzy Rhinolophus i zróżnicowanych filogenetycznie gatunków ssaków: myszy, ludzi, psów, świń i marmozet.

Przeprowadzono analizę ontologii genów, aby ocenić najnowocześniejsze wzbogacanie genów pod kątem określonych szlaków biologicznych. Opracowano nowe metody badawcze w oparciu o klasyfikację metagenomiczną danych zsekwencjonowanych kwasem rybonukleinowym (RNA) komórek macierzystych (sekwencja RNA), domniemane składanie kontigów retrowirusowych de novo oraz mapowanie genomu w celu identyfikacji odczytów retrowirusów w dobrej wierze. Ponadto zbadano markery antygenowe związane z wirusami RNA.

Wyniki badań

Specyficzny stosunek czynników przeprogramowujących, jak również dodatek czynnika wzrostu fibroblastów-2 (Fgf-2), czynnika komórek macierzystych (Scf), czynnika hamującego białaczkę (Lif) i forskoliny do pożywki hodowlanej umożliwiły niehamowany wzrost BiPSC, z jednorodnymi i gęstymi koloniami nietoperzy pojawiającymi się w ciągu 14 do 16 dni.

BiPSC wyrażały czynnik pluripotencji Oct4 z szybkością proliferacji identyczną z szybkością proliferacji ludzkich PSC. Większość komórek zawierała 56 chromosomów i replikowała się bez egzogennych czynników przeprogramowania i zmian morfologicznych.

BiPSC różnicowały się w trzy listki zarodkowe, a następnie tworzyły EB i organoidy. Analiza seq RNA wykazała indukowaną endogenną ekspresję kanonicznych genów związanych z pluripotencją, takich jak SRY-2, Nanog i Oct4.

Jednak profil genetyczny nie był całkowicie zgodny ze stanem pluripotencji. Zamiast tego wyrażono naiwne czynniki stanu pluripotencjalnego, takie jak Klf4 i 17, białko receptora beta związane z estrogenem (Essrb), czynnik transkrypcyjny E3 (Tfe3) i czynnik transkrypcyjny CP2 Like 1 (Tfcp2l1). Obserwowano koekspresję białka Tfcp2l1/palca cynkowego (Zic2) i Orthodenticle Homeobox 2 (Otx2)/Tfe3, a także czynniki pierwotne/naiwne.

Zmiany w konfiguracji chromatyny i metylacji CpG 191 zaobserwowano w całym genomie nietoperza. Wyniki ChiP-seq wykazały nakładanie się genów dwuwartościowych człowieka i nietoperza, chociaż niektóre geny były specyficzne gatunkowo.

BiPSC przeprogramowano transkrypcyjnie i epigenetycznie. BIPSC dały wynik dodatni pod względem markerów białka sparowanej skrzynki (Pax6), 213T i alfa-fetoproteiny (AFP) dla ektodermy, mezodermy i endodermy.

Gen ERAS uległ obniżeniu, podczas gdy geny hialuronidazy i czynników rybozylacji ADP (ARF) były nie do odróżnienia pomiędzy grupami. Blastaoidy Rhinolophus wykazywały struktury embrionalne związane ze spłaszczonym przerostem nabłonka trofoblastycznego i ekspansją wewnętrznej masy komórkowej. Wyniki badania nietoperzy Myotis sugerują, że protokół badania można zastosować do różnych gatunków nietoperzy.

Analiza PCA ujawniła odrębną grupę komórek macierzystych nietoperzy. Jednakże tylko osiem najważniejszych genów wykazało znaczącą selekcję pozytywną u R. ferrumequinum, przy czym większość genów należała do nieoczekiwanych kategorii. Co więcej, choroba CoV była najbardziej rozszerzoną kategorią w Encyklopedii genów i genomów z Kioto (KEGG).

W BiPSC wykryto geny kolagenu typu III alfa 1 (Col3a1) i mucyny 1 (Muc1), co wskazuje na adaptacje genetyczne specyficzne dla nietoperzy. Przeprogramowanie ujawniło sekwencje endogennych retrowirusów (ERV).

BiPSC zawierały wiele endogenizowanych sekwencji związanych z wirusami z regionami homologicznymi do ludzkiego wirusa opryszczki 4, ludzkiego wirusa syncytialnego układu oddechowego i izolatu SARS-CoV-2. Sekwencje genomowe R. ferrumequinum były podobne do sekwencji ludzkiego CoV 229E i ludzkiego CoV OC43.

Zidentyfikowano kilka miejsc integracji retrowirusów, które były homologiczne do wirusów, takich jak wirus małpy Masona-Pfizera, wirus koali i retrowirus owiec Jaagsiekte. Genom był homologiczny do wirusów nornicy, ospy wietrznej, ospy wiewiórczej, ospy małpiej i zespołu ospy białej.

Wnioski

Sekwencje BiPSC były podobne do sekwencji genomu wirusa. Zatem transkrypcyjnie permisywny stan pluripotencji nietoperzy można wykorzystać do odkrycia nowych sekwencji wirusów nietoperzy związanych z fizjologią nietoperzy i ich zdolnościami do przenoszenia wirusów.

Ten artykuł prasowy był recenzją wstępnego raportu naukowego, który nie był recenzowany w momencie publikacji. Od czasu pierwszej publikacji raport naukowy został poddany recenzji naukowej i zaakceptowany do publikacji w czasopiśmie akademickim. Linki do raportów wstępnych i recenzowanych można znaleźć w sekcji Źródła na końcu tego artykułu. Zobacz źródła

Referencje:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Dejosez, M., Marin, A., Hughes, GM, et al. (2022). Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren einzigartige Verflechtung zwischen Wirt und Viren. bioRxiv. doi:10.1101/2022.09.23.509261. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.23.509261v1.
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Déjosez, Marion, Arturo Marin, Graham M. Hughes, Ariadna E. Morales, Carlos Godoy-Parejo, Jonathan L. Gray, Yiren Qin, et al. 2023. „Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren ungewöhnliche Verflechtung zwischen Wirt und Viren.“ Zelle 186 (5): 957-974.e28. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.01.011. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867423000417.

Rewizje artykułu

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.