Células-tronco pluripotentes de morcego como modelo para estudo de novos vírus

Células-tronco pluripotentes de morcego como modelo para estudo de novos vírus

Os morcegos evoluíram com características únicas, como ecolocalização laríngea e voo, com alguns capazes de tolerar vírus como os coronavírus da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoVs), os CoVs da síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS-CoVs) e os vírus Marburg e Nipah. O desenvolvimento de modelos robustos de morcegos baseados em células poderá levar a uma melhor compreensão da gestão dos vírus dos morcegos e da sua biologia.

Em um estudo publicado recentemente sobre o assunto bioRxiv * Servidor de pré-impressão: Os pesquisadores geraram células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) de morcegos Rhinolophus ferrumequinum usando o protocolo Yamanaka modificado para estabelecer os morcegos como uma nova espécie de estudo modelo in vivo.

Estudar: Células-tronco pluripotentes de morcego revelam uma interconexão única entre hospedeiro e vírus.Crédito da foto: Jezper/Shutterstock.com

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Sobre o estudo

No presente estudo, os investigadores estão a investigar se os morcegos podem ser adequados para a produção de vírus.

A abordagem de reprogramação de Yamanaka foi usada com base em fatores de reprogramação, como o gene Y-box-2 da região determinante do sexo, fator de transcrição de ligação ao octâmero 4 (Oct4), cMyc e fator 4 semelhante a Kruppel (Klf4).

Células de fibroblastos embrionários de morcego (BEF) foram isoladas de R. ferrumequinum com níveis de fatores de reprogramação alterados para ativar e bloquear múltiplas vias de sinalização. Além disso, também foram realizadas análises de imunocoloração e sequenciamento de ácido ribonucleico (RNA) (RNA-seq).

Obtenção de células-tronco de morcego pluripotentes. (A) Ilustração da estratégia para obtenção de células-tronco de morcego pluripotentes. BEF, fibroblastos embrionários; OSMK, Oct4, Sox2, cMyc, Klf4; FB, meio de fibroblastos; PSC, meio de células-tronco pluripotentes; PSC+, PSC com aditivos. (B) Morfologia de colônias de células BiPS estabelecidas cultivadas em fibroblastos embrionários de camundongos. (C) Detecção de imunofluorescência de Oct4 em células BiPS. (D) Gráfico MA de dados de RNA-seq ilustrando as diferenças transcricionais entre fibroblastos embrionários de morcego (BEF) e células-tronco pluripotentes (BiPS). Genes selecionados com funções conhecidas no estabelecimento ou manutenção da pluripotência são destacados. (E) Análise de cluster Kmean de sinais ATAC-seq obtidos de células BEF ou BiPS. C, aglomerados. (F), Gráfico de densidade dos resultados de RRBS obtidos de células BEF e BiPS. PCC, coeficiente de correlação de Pearson. (G) Gráficos de dispersão do status de metilação da histona 3 em K4 (ativação da modificação da cromatina) ou K27 (modificação repressiva da cromatina) após ChIP-seq de células BEF ou BiPS, conforme indicado. (H) Gráfico de dispersão de H3K4me3 e H3K27me3 em células BiPS ilustrando a presença de sítios de cromatina bivalentes em células BiPS. (I) Sinais RNA-seq, ATAC-seq e H3K4me3 ou H3K27me3 ChIP-seq de genes selecionados com funções conhecidas na reprogramação que são ativados (Nanog, Kit) ou reprimidos (Thy1) em BiPS em comparação com células BEF.

Os efeitos do método de reprogramação modificado nas moléculas epigenéticas e na cromatina dos morcegos foram avaliados usando o ensaio de cromatina acessível por transposase com sequenciamento (ATAC-seq). Análises de mapeamento de metiloma de ácido desoxirribonucléico (DNA) e análises de imunoprecipitação e sequenciamento da cromatina (ChIP-seq) também foram realizadas. Os protocolos foram otimizados para permitir a diferenciação SC de morcegos nas três camadas germinativas, enquanto o ensaio de diferenciação do corpo embrionário (EB) foi realizado para avaliar a pluripotência.

Bat iPSCs (BiPSCs) foram então injetados em camundongos imunossuprimidos e estruturas embrionárias foram criadas a partir dos BiPSCs. O protocolo do estudo foi validado através do desenvolvimento de células BiPS do morcego evolutivamente distante Myotis myotis.

O perfil gênico transcricional comparativo e a análise de componentes principais (PCA) foram realizados nas espécies de morcegos Rhinolophus e em espécies de mamíferos filogeneticamente diversas de camundongos, humanos, cães, porcos e saguis.

A análise de ontologia genética foi realizada para avaliar o enriquecimento genético de última geração para vias biológicas específicas. Novos pipelines foram desenvolvidos com base na classificação metagenômica de dados sequenciados de ácido ribonucleico (RNA) de células-tronco (RNA-seq), suposta montagem de contig retroviral de novo e mapeamento genômico para identificar leituras retrovirais genuínas. Além disso, foram examinados marcadores de antígenos associados a vírus de RNA.

Resultados do estudo

Uma proporção específica de fator de reprogramação, bem como a adição de fator de crescimento de fibroblastos-2 (Fgf-2), fator de células-tronco (Scf), fator inibitório de leucemia (Lif) e forscolina ao meio de cultura permitiram o crescimento desinibido de BiPSC, com colônias de morcegos homogêneas e densas aparecendo dentro de 14 a 16 dias.

Os BiPSCs expressaram o fator de pluripotência Oct4 a uma taxa de proliferação idêntica à taxa de proliferação de PSCs humanos. A maioria das células continha 56 cromossomos e foi replicada sem fatores de reprogramação exógenos e alterações morfológicas.

BiPSCs diferenciaram-se nas três camadas germinativas e posteriormente formaram EBs e organoides. A análise de RNA-seq mostrou expressão endógena induzida de genes canônicos relacionados à pluripotência, como SRY-2, Nanog e Oct4.

No entanto, o perfil genético não era totalmente consistente com um estado de pluripotência. Em vez disso, foram expressos fatores de estado pluripotentes ingênuos, como Klf4 e 17, proteína beta receptora relacionada ao estrogênio (Essrb), fator de transcrição E3 (Tfe3) e fator de transcrição CP2 Like 1 (Tfcp2l1). Foram observados co-expressos Tfcp2l1/proteína de dedo de zinco (Zic2) e Orthodenticle Homeobox 2 (Otx2)/Tfe3, bem como fatores iniciados/naïve.

Mudanças na configuração da cromatina e metilação do CpG 191 foram observadas em todo o genoma do morcego. Os resultados do ChiP-seq mostraram sobreposição entre genes de bivalência humana e de morcego, embora alguns genes fossem específicos da espécie.

BiPSCs foram reprogramados transcricionalmente e epigeneticamente. BIPSCs foram positivos para marcadores de proteína de caixa pareada (Pax6), 213T e alfa-fetoproteína (AFP) para ectoderme, mesoderme e endoderme.

O gene ERAS foi regulado negativamente, enquanto os genes para hialuronidases e fatores de ribosilação de ADP (ARFs) eram indistinguíveis entre os grupos. Os blastóides Rhinolophus apresentaram estruturas embrionárias ligadas a um crescimento epitelial trofoblástico achatado e expansão da massa celular interna. Os resultados do morcego Myotis sugeriram que o protocolo do estudo poderia ser aplicado a diferentes espécies de morcegos.

A análise de PCA revelou um grupo distinto de células-tronco de morcego. No entanto, apenas oito genes principais mostraram seleção positiva significativa em R. ferrumequinum, com a maioria dos genes pertencentes a categorias inesperadas. Além disso, a doença CoV foi a categoria mais significativamente expandida na Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG).

Os genes do colágeno tipo III alfa 1 (Col3a1) e mucina 1 (Muc1) foram detectados em BiPSCs, indicando adaptações genéticas específicas para morcegos. A reprogramação revelou sequências de retrovírus endógenos (ERV).

BiPSCs continham múltiplas sequências endogenizadas associadas a vírus com regiões homólogas ao herpesvírus humano 4, vírus sincicial respiratório humano e um isolado de SARS-CoV-2. As sequências genômicas de R. ferrumequinum foram semelhantes às do CoV 229E humano e do CoV OC43 humano.

Foram identificados vários locais de integração retroviral que eram homólogos a vírus, como o vírus do macaco Mason-Pfizer, o vírus coala e o retrovírus de ovelha Jaagsiekte. O genoma era homólogo aos vírus da varíola volepox, varíola, varíola do esquilo, varíola dos macacos e varíola branca.

Conclusões

As sequências BiPSC foram semelhantes às sequências do genoma viral. Assim, o estado de pluripotência transcricionalmente permissivo dos morcegos poderia ser explorado para descobrir novas sequências de vírus de morcego envolvidas na fisiologia dos morcegos e nas suas capacidades de hospedagem de vírus.

Esta notícia foi uma revisão de um relatório científico preliminar que não havia sido revisado por pares no momento da publicação. Desde a sua publicação inicial, o relatório científico foi agora revisto por pares e aceite para publicação numa revista académica. Links para os relatórios preliminares e revisados ​​por pares podem ser encontrados na seção Fontes no final deste artigo. Ver fontes

Referências:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Dejosez, M., Marin, A., Hughes, GM, et al. (2022). Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren einzigartige Verflechtung zwischen Wirt und Viren. bioRxiv. doi:10.1101/2022.09.23.509261. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.23.509261v1.
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Déjosez, Marion, Arturo Marin, Graham M. Hughes, Ariadna E. Morales, Carlos Godoy-Parejo, Jonathan L. Gray, Yiren Qin, et al. 2023. „Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren ungewöhnliche Verflechtung zwischen Wirt und Viren.“ Zelle 186 (5): 957-974.e28. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.01.011. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867423000417.

Revisões de artigos

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.