Celulele stem pluripotente de lilieci ca model pentru studierea noilor virusuri

Celulele stem pluripotente de lilieci ca model pentru studierea noilor virusuri

Liliecii au evoluat cu caracteristici unice, cum ar fi ecolocația laringiană și zborul, unii fiind capabili să tolereze viruși precum coronavirusurile cu sindrom respirator acut sever (SARS-CoV), sindromul respirator din Orientul Mijlociu CoV (MERS-CoV) și virusurile Marburg și Nipah. Dezvoltarea unor modele robuste de lilieci bazate pe celule ar putea duce la o mai bună înțelegere a managementului virusului liliecilor și a biologiei acestora.

Într-un studiu publicat recent pe această temă bioRxiv * Server Preprint: Cercetătorii au generat celule stem pluripotente induse (iPSCs) de la liliecii Rhinolophus ferrumequinum folosind protocolul Yamanaka modificat pentru a stabili liliecii ca o specie nouă de studiu model in vivo.

Studiu: Celulele stem pluripotente de lilieci dezvăluie interconexiune unică gazdă-virus.Credit foto: Jezper / Shutterstock.com

Acest articol de știri a fost o revizuire a unui raport științific preliminar care nu a fost revizuit de colegi la momentul publicării. De la publicarea sa inițială, raportul științific a fost acum revizuit de colegi și acceptat pentru publicare într-o jurnal academic. Link-uri către rapoartele preliminare și revizuite de colegi pot fi găsite în secțiunea Surse de la sfârșitul acestui articol. Vizualizați sursele

Despre studiu

În studiul de față, cercetătorii investighează dacă liliecii ar putea fi potriviți pentru producerea de virusuri.

Abordarea de reprogramare Yamanaka a fost utilizată pe baza factorilor de reprogramare, cum ar fi gena Y-box-2 a regiunii care determină sexul, factorul de transcripție de legare octamer 4 (Oct4), cMyc și factorul 4 asemănător Kruppel (Klf4).

Celulele fibroblaste embrionare de lilieci (BEF) au fost izolate din R. ferrumequinum cu nivelurile de factori de reprogramare modificate pentru a activa și bloca căile multiple de semnalizare. În plus, au fost efectuate și analize de imunocolorare și secvențiere a acidului ribonucleic (ARN) (ARN-seq).

Obținerea de celule stem de lilieci pluripotente. (A) Ilustrație a strategiei de obținere a celulelor stem de lilieci pluripotente. BEF, fibroblaste embrionare; OSMK, Oct4, Sox2, cMyc, Klf4; FB, mediu fibroblast; PSC, mediu de celule stem pluripotente; PSC+, PSC cu aditivi. (B) Morfologia coloniilor de celule BiPS stabilite crescute pe fibroblaste embrionare de șoarece. (C) Detectarea imunofluorescenței Oct4 în celulele BiPS. (D) Graficul MA al datelor ARN-seq care ilustrează diferențele transcripționale dintre fibroblastele embrionare de lilieci (BEF) și celulele stem pluripotente (BiPS). Sunt evidențiate gene selectate cu funcții cunoscute în stabilirea sau menținerea pluripotenței. (E) Analiza grupului Kmean a semnalelor ATAC-seq obținute din celulele BEF sau BiPS. C, clustere. (F), Diagrama densității rezultatelor RRBS obținute din celulele BEF și BiPS. PCC, coeficientul de corelație Pearson. (G) Scatterplots ale stării de metilare a histonei 3 la K4 (activarea modificării cromatinei) sau K27 (modificarea represivă a cromatinei) după ChIP-seq din celulele BEF sau BiPS, așa cum este indicat. (H) Graficul de dispersie a H3K4me3 și H3K27me3 în celulele BiPS care ilustrează prezența situsurilor de cromatină bivalentă în celulele BiPS. (I) Semnale ARN-seq, ATAC-seq și H3K4me3 sau H3K27me3 ChIP-seq ale genelor selectate cu roluri cunoscute în reprogramare care sunt activate (Nanog, Kit) sau reprimate (Thy1) în BiPS în comparație cu celulele BEF.

Efectele metodei de reprogramare modificate asupra moleculelor epigenetice de lilieci și cromatinei au fost evaluate utilizând testul de cromatina accesibilă transpozazei cu secvențiere (ATAC-seq). De asemenea, au fost efectuate analize de cartografiere a metilomului acidului dezoxiribonucleic (ADN) și analize de imunoprecipitare și secvențiere a cromatinei (ChIP-seq). Protocoalele au fost optimizate pentru a permite diferențierea SC a liliecilor în cele trei straturi germinale, în timp ce testul de diferențiere a corpului embrionar (EB) a fost efectuat pentru a evalua pluripotența.

IPSC-urile de lilieci (BiPSC) au fost apoi injectate în șoareci imunodeprimați și structurile embrionare au fost create din BiPSC. Protocolul de studiu a fost validat prin dezvoltarea celulelor BiPS de la liliacul îndepărtat evolutiv Myotis myotis.

Profilul comparativ al genelor transcripționale și analizele componentelor principale (PCA) au fost efectuate la speciile de lilieci Rhinolophus și specii de mamifere diverse din punct de vedere filogenetic de șoareci, oameni, câini, porci și marmosets.

Analiza ontologiei genelor a fost efectuată pentru a evalua îmbogățirea genelor de ultimă generație pentru căi biologice specifice. Au fost dezvoltate noi conducte pe baza clasificării metagenomice a datelor secvențiate de acid ribonucleic (ARN) de celule stem (ARN-seq), asamblarea contig retroviral presupusă de novo și cartografierea genomică pentru a identifica citirile retrovirale de bună credință. În plus, au fost examinați markeri de antigen asociați cu virusurile ARN.

Rezultatele studiului

Un raport specific de factor de reprogramare, precum și adăugarea factorului de creștere a fibroblastelor-2 (Fgf-2), a factorului de celule stem (Scf), a factorului inhibitor de leucemie (Lif) și a forskolinei la mediul de cultură a permis creșterea BiPSC neinhibată, cu colonii de lilieci omogene și dense apărând în decurs de 14 până la 16 zile.

BiPSC-urile au exprimat factorul de pluripotență Oct4 la o rată de proliferare identică cu rata de proliferare a PSC-urilor umane. Majoritatea celulelor conțineau 56 de cromozomi și s-au replicat fără factori de reprogramare exogeni și modificări morfologice.

BiPSC-urile s-au diferențiat în cele trei straturi germinale și, ulterior, au format EB și organoizi. Analiza ARN-seq a arătat expresia endogenă indusă a genelor legate de pluripotența canonică, cum ar fi SRY-2, Nanog și Oct4.

Cu toate acestea, profilul genetic nu a fost complet în concordanță cu o stare de pluripotență. În schimb, au fost exprimați factori de stare pluripotenți naivi, cum ar fi Klf4 și 17, proteina beta receptorului legat de estrogen (Essrb), factorul de transcripție E3 (Tfe3) și factorul de transcripție CP2 Like 1 (Tfcp2l1). Au fost observați coexprimați Tfcp2l1/proteina deget de zinc (Zic2) și Orthodenticle Homeobox 2 (Otx2)/Tfe3, precum și factori amorsați/naivi.

Modificări în configurația cromatinei și metilarea CpG 191 au fost observate în tot genomul liliecilor. Rezultatele ChiP-seq au arătat o suprapunere între genele bivalenței umane și ale liliecilor, deși unele gene erau specifice speciei.

BiPSC-urile au fost reprogramate transcripțional și epigenetic. BIPSC-urile au fost pozitive pentru proteina cutie pereche (Pax6), 213T și markerii alfa-fetoprotein (AFP) pentru ectoderm, mezoderm și endoderm.

Gena ERAS a fost reglată în jos, în timp ce genele pentru hialuronidaze și factorii de ribozilare ADP (ARF) nu se distingeau între grupuri. Blastoizii Rhinolophus au arătat structuri embrionare legate de o excrescență epitelială trofoblastică aplatizată și de expansiune a masei celulare interne. Rezultatele liliecilor Myotis au sugerat că protocolul de studiu ar putea fi aplicat diferitelor specii de lilieci.

Analiza PCA a relevat un grup distinct de celule stem de lilieci. Cu toate acestea, doar opt gene de top au arătat o selecție pozitivă semnificativă în R. ferrumequinum, majoritatea genelor aparținând unor categorii neașteptate. Mai mult, boala CoV a fost cea mai semnificativ extinsă categorie din Enciclopedia Kyoto a Genelor și Genomelor (KEGG).

Genele de colagen de tip III alfa 1 (Col3a1) și mucină 1 (Muc1) au fost detectate în BiPSC, indicând adaptări genetice specifice liliecilor. Reprogramarea a evidențiat secvențe de retrovirus endogene (ERV).

BiPSC-urile au conținut multiple secvențe endogene asociate virusului cu regiuni omoloage herpesvirusului uman 4, virusului respirator sincițial uman și un izolat SARS-CoV-2. Secvențele genomice ale R. ferrumequinum au fost similare cu cele ale CoV 229E uman și CoV OC43 uman.

Au fost identificate mai multe situsuri de integrare retrovirală care au fost omoloage cu viruși precum virusul maimuței Mason-Pfizer, virusul koala și retrovirusul oilor Jaagsiekte. Genomul a fost omologul virusurilor volepox, variolei, veveriței, variolei maimuțelor și sindromului whitepox.

Concluzii

Secvențele BiPSC au fost similare cu secvențele genomului viral. Astfel, starea de pluripotență permisivă din punct de vedere transcripțional a liliecilor ar putea fi exploatată pentru a descoperi noi secvențe de virus lilieci implicate în fiziologia liliecilor și abilitățile lor de găzduire a virusului.

Acest articol de știri a fost o revizuire a unui raport științific preliminar care nu a fost revizuit de colegi la momentul publicării. De la publicarea sa inițială, raportul științific a fost acum revizuit de colegi și acceptat pentru publicare într-o jurnal academic. Link-uri către rapoartele preliminare și revizuite de colegi pot fi găsite în secțiunea Surse de la sfârșitul acestui articol. Vizualizați sursele

Referinte:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Dejosez, M., Marin, A., Hughes, GM, et al. (2022). Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren einzigartige Verflechtung zwischen Wirt und Viren. bioRxiv. doi:10.1101/2022.09.23.509261. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.23.509261v1.
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Déjosez, Marion, Arturo Marin, Graham M. Hughes, Ariadna E. Morales, Carlos Godoy-Parejo, Jonathan L. Gray, Yiren Qin, et al. 2023. „Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren ungewöhnliche Verflechtung zwischen Wirt und Viren.“ Zelle 186 (5): 957-974.e28. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.01.011. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867423000417.

Revizuirile articolului

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.