Pluripotentne matične celice netopirjev kot model za preučevanje novih virusov

Pluripotentne matične celice netopirjev kot model za preučevanje novih virusov

Netopirji so se razvili z edinstvenimi značilnostmi, kot sta laringealna eholokacija in let, pri čemer so nekateri sposobni prenašati viruse, kot so koronavirusi hudega akutnega respiratornega sindroma (SARS-CoV), bližnjevzhodni respiratorni sindrom CoV (MERS-CoV) ter virusa Marburg in Nipah. Razvoj robustnih celičnih modelov netopirjev bi lahko privedel do boljšega razumevanja obvladovanja virusov netopirjev in njihove biologije.

V nedavno objavljeni študiji na to temo bioRxiv * Strežnik prednatisa: Raziskovalci so ustvarili inducirane pluripotentne matične celice (iPSC) iz netopirjev Rhinolophus ferrumequinum z uporabo spremenjenega protokola Yamanaka, da bi netopirje uvedli kot novo in vivo modelno študijsko vrsto.

študija: Pluripotentne izvorne celice netopirjev razkrivajo edinstveno medsebojno povezavo gostitelj-virus.Avtor fotografije: Jezper / Shutterstock.com

Ta članek je bil pregled predhodnega znanstvenega poročila, ki v času objave ni bilo strokovno pregledano. Od prve objave je bilo znanstveno poročilo strokovno pregledano in sprejeto za objavo v akademski reviji. Povezave do predhodnih in strokovno pregledanih poročil lahko najdete v razdelku Viri na koncu tega članka. Ogled virov

O študiju

V tej študiji raziskovalci preiskujejo, ali so netopirji primerni za proizvodnjo virusov.

Pristop reprogramiranja Yamanaka je bil uporabljen na podlagi dejavnikov reprogramiranja, kot so gen Y-box-2, ki določa spol, transkripcijski faktor 4 (Oct4), ki veže oktamer, cMyc in Kruppelu podoben faktor 4 (Klf4).

Celice netopirskega embrionalnega fibroblasta (BEF) so bile izolirane iz R. ferrumequinum s spremenjenimi ravnmi faktorjev reprogramiranja, da aktivirajo in blokirajo več signalnih poti. Poleg tega so bile izvedene tudi analize imunskega barvanja in sekvenciranja ribonukleinske kisline (RNA) (RNA-seq).

Pridobivanje pluripotentnih matičnih celic netopirjev. (A) Ilustracija strategije za pridobivanje pluripotentnih matičnih celic netopirjev. BEF, embrionalni fibroblasti; OSMK, Oct4, Sox2, cMyc, Klf4; FB, fibroblastni medij; PSC, medij pluripotentnih izvornih celic; PSC+, PSC z dodatki. (B) Morfologija vzpostavljenih celičnih kolonij BiPS, gojenih na mišjih embrionalnih fibroblastih. (C) Imunofluorescenčna detekcija Oct4 v celicah BiPS. (D) MA graf podatkov RNA-seq, ki ponazarja transkripcijske razlike med fibroblasti embrionalnih netopirjev (BEF) in pluripotentnimi izvornimi celicami (BiPS). Poudarjeni so izbrani geni z znanimi funkcijami pri vzpostavljanju ali ohranjanju pluripotentnosti. (E) Kmean analiza grozdov signalov ATAC-seq, pridobljenih iz celic BEF ali BiPS. C, grozdi. (F), Graf gostote rezultatov RRBS, pridobljenih iz celic BEF in BiPS. PCC, Pearsonov korelacijski koeficient. (G) Raztreseni grafikoni statusa metilacije histona 3 pri K4 (aktivacija modifikacije kromatina) ali K27 (represivna modifikacija kromatina) po ChIP-seq iz celic BEF ali BiPS, kot je navedeno. (H) Raztreseni grafikon H3K4me3 in H3K27me3 v celicah BiPS, ki ponazarja prisotnost mest dvovalentnega kromatina v celicah BiPS. (I) RNA-seq, ATAC-seq in H3K4me3 ali H3K27me3 ChIP-seq signali izbranih genov z znanimi vlogami pri reprogramiranju, ki so aktivirani (Nanog, Kit) ali potlačeni (Thy1) v BiPS v primerjavi s celicami BEF.

Učinke spremenjene metode reprogramiranja na epigenetske molekule netopirjev in kromatin so ocenili z uporabo transpozazno dostopnega kromatina s sekvenciranjem (ATAC-seq). Izvedene so bile tudi analize kartiranja metiloma deoksiribonukleinske kisline (DNA) ter analize imunoprecipitacije in sekvenciranja kromatina (ChIP-seq). Protokoli so bili optimizirani, da so omogočili diferenciacijo netopirjev v tri zarodne plasti, medtem ko je bil za oceno pluripotence izveden test diferenciacije telesca zarodka (EB).

Netopirske iPSC (BiPSC) so nato vbrizgali v imunosupresirane miši in iz BiPSC so ustvarili embrionalne strukture. Protokol študije je bil potrjen z razvojem celic BiPS iz evolucijsko oddaljenega netopirja Myotis myotis.

Primerjalno transkripcijsko profiliranje genov in analize glavnih komponent (PCA) so bile izvedene pri vrsti netopirjev Rhinolophus in filogenetsko raznolikih vrstah sesalcev miši, ljudi, psov, prašičev in marmozetk.

Analiza genske ontologije je bila izvedena za oceno najsodobnejše obogatitve genov za specifične biološke poti. Na podlagi metagenomske klasifikacije podatkov matičnih celic, sekvenciranih z ribonukleinsko kislino (RNA) (RNA-seq), de novo domnevnega sestavljanja retrovirusnih kontigov in genomskega kartiranja za identifikacijo verodostojnih retrovirusnih odčitkov so bili razviti novi cevovodi. Poleg tega so bili pregledani antigenski markerji, povezani z virusi RNA.

Rezultati študije

Specifično razmerje faktorjev reprogramiranja kot tudi dodatek rastnega faktorja fibroblastov-2 (Fgf-2), faktorja matičnih celic (Scf), inhibitornega faktorja levkemije (Lif) in forskolina v gojišče je omogočilo neovirano rast BiPSC, s homogenimi in gostimi kolonijami netopirjev, ki so se pojavile v 14 do 16 dneh.

BiPSC so izrazili faktor pluripotentnosti Oct4 pri stopnji proliferacije, ki je enaka stopnji proliferacije človeških PSC. Večina celic je vsebovala 56 kromosomov in se razmnoževala brez eksogenih faktorjev reprogramiranja in morfoloških sprememb.

BiPSC so se diferencirali v tri zarodne plasti in nato oblikovali EB in organoide. Analiza RNA-seq je pokazala inducirano endogeno izražanje kanoničnih genov, povezanih s pluripotenco, kot so SRY-2, Nanog in Oct4.

Vendar pa genetski profil ni bil popolnoma skladen s stanjem pluripotentnosti. Namesto tega so bili izraženi naivni pluripotentni faktorji stanja, kot sta Klf4 in 17, z estrogenom povezani receptorski protein beta (Essrb), transkripcijski faktor E3 (Tfe3) in transkripcijski faktor CP2 Like 1 (Tfcp2l1). Opaženi so bili sočasno izraženi Tfcp2l1/cinkov prstni protein (Zic2) in Orthodenticle Homeobox 2 (Otx2)/Tfe3 ter primarni/naivni faktorji.

Spremembe v konfiguraciji kromatina in metilaciji CpG 191 so opazili v celotnem genomu netopirjev. Rezultati ChiP-seq so pokazali prekrivanje med bivalentnimi geni za človeka in netopirjev, čeprav so bili nekateri geni specifični za vrsto.

BiPSC so bili transkripcijsko in epigenetsko reprogramirani. BIPSC so bili pozitivni na markerje seznanjenega box proteina (Pax6), 213T in alfa-fetoproteina (AFP) za ektoderm, mezoderm in endoderm.

Gen ERAS je bil znižan, medtem ko genov za hialuronidaze in ADP-ribozilacijske faktorje (ARF) ni bilo mogoče razlikovati med skupinami. Rhinolophus blastoidi so pokazali embrionalne strukture, povezane s sploščenim trofoblastnim epitelijskim izrastkom in notranjo ekspanzijo celične mase. Rezultati netopirja Myotis so pokazali, da bi lahko protokol študije uporabili za različne vrste netopirjev.

Analiza PCA je razkrila posebno skupino matičnih celic netopirjev. Vendar je le osem vrhunskih genov pokazalo pomembno pozitivno selekcijo pri R. ferrumequinum, pri čemer je večina genov pripadala nepričakovanim kategorijam. Poleg tega je bila bolezen CoV najbolj razširjena kategorija v Kjotski enciklopediji genov in genomov (KEGG).

Geni kolagena tipa III alfa 1 (Col3a1) in mucina 1 (Muc1) so bili odkriti v BiPSC, kar kaže na genetske prilagoditve, specifične za netopirje. Reprogramiranje je razkrilo sekvence endogenega retrovirusa (ERV).

BiPSC so vsebovali več z virusom povezanih endogeniziranih sekvenc z regijami, homolognimi človeškemu herpesvirusu 4, človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu in izolatu SARS-CoV-2. Genomska zaporedja R. ferrumequinum so bila podobna zaporedjem človeškega CoV 229E in človeškega CoV OC43.

Identificiranih je bilo več retrovirusnih integracijskih mest, ki so bila homologna virusom, kot so opičji virus Mason-Pfizer, virus koale in ovčji retrovirus Jaagsiekte. Genom je bil homologen virusom voluharice, variole, veveričjih koz, opičjih koz in sindroma belih koz.

Sklepi

Sekvence BiPSC so bile podobne sekvencam virusnega genoma. Tako bi lahko transkripcijsko permisivno pluripotentno stanje netopirjev izkoristili za odkrivanje novih sekvenc virusa netopirjev, ki so vključeni v fiziologijo netopirjev in njihove sposobnosti gostovanja virusov.

Ta članek je bil pregled predhodnega znanstvenega poročila, ki v času objave ni bilo strokovno pregledano. Od prve objave je bilo znanstveno poročilo strokovno pregledano in sprejeto za objavo v akademski reviji. Povezave do predhodnih in strokovno pregledanih poročil lahko najdete v razdelku Viri na koncu tega članka. Ogled virov

Reference:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Dejosez, M., Marin, A., Hughes, GM, et al. (2022). Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren einzigartige Verflechtung zwischen Wirt und Viren. bioRxiv. doi:10.1101/2022.09.23.509261. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.23.509261v1.
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Déjosez, Marion, Arturo Marin, Graham M. Hughes, Ariadna E. Morales, Carlos Godoy-Parejo, Jonathan L. Gray, Yiren Qin, et al. 2023. „Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren ungewöhnliche Verflechtung zwischen Wirt und Viren.“ Zelle 186 (5): 957-974.e28. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.01.011. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867423000417.

Revizije člankov

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.