Pluripotenta fladdermusstamceller som modell för att studera nya virus

Pluripotenta fladdermusstamceller som modell för att studera nya virus

Fladdermöss har utvecklats med unika egenskaper som larynx-ekolokalisering och flygning, med några som kan tolerera virus som koronavirus för allvarligt akut respiratoriskt syndrom (SARS-CoVs), Middle East respiratory syndrome CoVs (MERS-CoVs) och Marburg- och Nipah-virus. Utvecklingen av robusta cellbaserade fladdermusmodeller kan leda till en bättre förståelse av fladdermusvirushanteringen och deras biologi.

I en nyligen publicerad studie i ämnet bioRxiv * Preprint-server: Forskare genererade inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) från Rhinolophus ferrumequinum-fladdermöss med hjälp av det modifierade Yamanaka-protokollet för att etablera fladdermöss som en ny in vivo-modellstudieart.

Studera: Bat pluripotenta stamceller avslöjar unik värd-virus sammankoppling.Fotokredit: Jezper / Shutterstock.com

Den här nyhetsartikeln var en recension av en preliminär vetenskaplig rapport som inte hade granskats av experter vid tidpunkten för publiceringen. Sedan den första publiceringen har den vetenskapliga rapporten nu granskats och godkänts för publicering i en akademisk tidskrift. Länkar till de preliminära och expertgranskade rapporterna finns i avsnittet Källor i slutet av den här artikeln. Visa källor

Om studien

I den aktuella studien undersöker forskare om fladdermöss kan vara lämpliga för virusproduktion.

Yamanaka-omprogrammeringsmetoden användes baserat på omprogrammeringsfaktorer såsom den könsbestämmande regionen Y-box-2-genen, oktamerbindande transkriptionsfaktor 4 (Oct4), cMyc och Kruppel-liknande faktor 4 (Klf4).

Embryonala fibroblastceller från fladdermus (BEF) isolerades från R. ferrumequinum med nivåer av omprogrammeringsfaktorer ändrade för att aktivera och blockera flera signalvägar. Dessutom utfördes immunfärgning och ribonukleinsyra (RNA) sekvensering (RNA-seq) analyser.

Att få pluripotenta fladdermusstamceller. (A) Illustration av strategin för att erhålla pluripotenta fladdermusstamceller. BEF, embryonala fibroblaster; OSMK, Oct4, Sox2, cMyc, Klf4; FB, fibroblastmedium; PSC, pluripotent stamcellsmedium; PSC+, PSC med tillsatser. (B) Morfologi av etablerade BiPS-cellkolonier odlade på musembryonala fibroblaster. (C) Immunfluorescensdetektion av Oct4 i BiPS-celler. (D) MA-plot av RNA-seq-data som illustrerar transkriptionsskillnaderna mellan fladdermusembryonala fibroblaster (BEF) och pluripotenta stamceller (BiPS). Utvalda gener med kända funktioner för att etablera eller upprätthålla pluripotens är markerade. (E) Kmean-klusteranalys av ATAC-seq-signaler erhållna från BEF- eller BiPS-celler. C, kluster. (F), Densitetsdiagram för RRBS-resultat erhållna från BEF- och BiPS-celler. PCC, Pearson korrelationskoefficient. (G) Scatterplots av histon 3-metyleringsstatus vid K4 (aktiverande kromatinmodifiering) eller K27 (repressiv kromatinmodifiering) efter ChIP-seq från BEF- eller BiPS-celler, enligt vad som anges. (H) Spridningsdiagram av H3K4me3 och H3K27me3 i BiPS-celler som illustrerar närvaron av bivalenta kromatinställen i BiPS-celler. (I) RNA-seq, ATAC-seq och H3K4me3 eller H3K27me3 ChIP-seq signaler av utvalda gener med kända roller i omprogrammering som är aktiverade (Nanog, Kit) eller undertryckta (Thy1) i BiPS jämfört med BEF-celler.

Effekterna av den modifierade omprogrammeringsmetoden på fladdermus epigenetiska molekyler och kromatin utvärderades med hjälp av den transposas-tillgängliga kromatin med sekvensering (ATAC-seq) analys. Deoxiribonukleinsyra (DNA) metylomkartläggningsanalyser och kromatinimmunutfällnings- och sekvensanalyser (ChIP-seq) utfördes också. Protokoll optimerades för att tillåta SC-differentiering av fladdermöss i de tre groddskikten, medan embryoidkroppsdifferentiering (EB) utfördes för att bedöma pluripotens.

Bat iPSCs (BiPSCs) injicerades sedan i immunsupprimerade möss och embryonala strukturer skapades från BiPSCs. Studieprotokollet validerades genom att utveckla BiPS-celler från den evolutionärt avlägsna fladdermusen Myotis myotis.

Jämförande transkriptionell genprofilering och huvudkomponentanalyser (PCA) utfördes i fladdermusarterna Rhinolophus och fylogenetiskt olika däggdjursarter av möss, människor, hundar, grisar och silkesapa.

Genontologianalys utfördes för att bedöma den senaste genanrikningen för specifika biologiska vägar. Nya pipelines har utvecklats baserat på metagenomisk klassificering av stamcellsribonukleinsyra (RNA)-sekvenserade (RNA-seq) data, de novo förmodad retroviral contig-sammansättning och genomisk kartläggning för att identifiera bona fide retrovirala läsningar. Dessutom undersöktes antigenmarkörer associerade med RNA-virus.

Studieresultat

Ett specifikt omprogrammeringsfaktorförhållande samt tillsatsen av fibroblasttillväxtfaktor-2 (Fgf-2), stamcellsfaktor (Scf), leukemihämmande faktor (Lif) och forskolin till odlingsmediet möjliggjorde ohämmad BiPSC-tillväxt, med homogena och täta fladdermuskolonier som uppträdde inom 14 till 16 dagar.

BiPSCs uttryckte Oct4 pluripotensfaktor vid en spridningshastighet identisk med spridningshastigheten för humana PSCs. De flesta celler innehöll 56 kromosomer och replikerades utan exogena omprogrammeringsfaktorer och morfologiska förändringar.

BiPSCs differentierade i de tre groddskikten och bildade därefter EB:s och organoider. RNA-seq-analys visade inducerat endogent uttryck av kanoniska pluripotensrelaterade gener som SRY-2, Nanog och Oct4.

Den genetiska profilen var dock inte helt förenlig med ett pluripotenstillstånd. Istället uttrycktes naiva pluripotenta tillståndsfaktorer som Klf4 och 17, östrogenrelaterat receptorbetaprotein (Essrb), transkriptionsfaktor E3 (Tfe3) och transkriptionsfaktor CP2 Like 1 (Tfcp2l1). Samuttryckt Tfcp2l1/zinkfingerprotein (Zic2) och Orthodenticle Homeobox 2 (Otx2)/Tfe3 såväl som förberedda/naiva faktorer observerades.

Förändringar i kromatinkonfiguration och CpG 191-metylering observerades i hela fladdermusgenomet. ChiP-seq-resultat visade överlappning mellan humana och fladdermusbivalensgener, även om vissa gener var artspecifika.

BiPSCs omprogrammerades transkriptionellt och epigenetiskt. BIPSCs var positiva för markörer för parat boxprotein (Pax6), 213T och alfa-fetoprotein (AFP) för ektoderm, mesoderm och endoderm.

ERAS-genen nedreglerades, medan generna för hyaluronidaser och ADP-ribosyleringsfaktorer (ARF) inte kunde särskiljas mellan grupper. Rhinolophus blastoider visade embryonala strukturer bundna till en tillplattad trofoblastisk epitelial utväxt och intern cellmassaexpansion. Myotis-fladdermusresultaten antydde att studieprotokollet kunde tillämpas på olika fladdermusarter.

PCA-analys avslöjade en distinkt grupp av fladdermusstamceller. Men endast åtta toppgener visade signifikant positiv selektion i R. ferrumequinum, med de flesta gener som tillhör oväntade kategorier. Dessutom var CoV-sjukdom den mest signifikant utökade kategorin i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).

Kollagen typ III alfa 1 (Col3a1) och mucin 1 (Muc1) gener detekterades i BiPSCs, vilket indikerar fladdermusspecifika genetiska anpassningar. Omprogrammeringen avslöjade endogena retrovirus (ERV) sekvenser.

BiPSCs innehöll flera virusassocierade endogeniserade sekvenser med regioner homologa med humant herpesvirus 4, humant respiratoriskt syncytialvirus och ett SARS-CoV-2-isolat. De genomiska sekvenserna för R. ferrumequinum liknade de för humant CoV 229E och humant CoV OC43.

Flera retrovirala integrationsställen identifierades som var homologa med virus såsom Mason-Pfizer apvirus, koalavirus och Jaagsiekte fårretrovirus. Genomet var homologt med virus av svamp-, variola-, ekorrkoppor, apkoppor och vitkoppor.

Slutsatser

BiPSC-sekvenser liknade virala genomsekvenser. Således kunde det transkriptionellt tillåtande pluripotenstillståndet hos fladdermöss utnyttjas för att upptäcka nya fladdermusvirussekvenser involverade i fladdermusfysiologi och deras virusvärdande förmåga.

Den här nyhetsartikeln var en recension av en preliminär vetenskaplig rapport som inte hade granskats av experter vid tidpunkten för publiceringen. Sedan den första publiceringen har den vetenskapliga rapporten nu granskats och godkänts för publicering i en akademisk tidskrift. Länkar till de preliminära och expertgranskade rapporterna finns i avsnittet Källor i slutet av den här artikeln. Visa källor

Referenser:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Dejosez, M., Marin, A., Hughes, GM, et al. (2022). Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren einzigartige Verflechtung zwischen Wirt und Viren. bioRxiv. doi:10.1101/2022.09.23.509261. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.23.509261v1.
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Déjosez, Marion, Arturo Marin, Graham M. Hughes, Ariadna E. Morales, Carlos Godoy-Parejo, Jonathan L. Gray, Yiren Qin, et al. 2023. „Pluripotente Stammzellen von Fledermäusen offenbaren ungewöhnliche Verflechtung zwischen Wirt und Viren.“ Zelle 186 (5): 957-974.e28. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.01.011. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0092867423000417.

Artikelrevisioner

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.