Структурен анализ на вируса на маймунската шарка за насочване на разработването на цялостни антивирусни средства

Структурен анализ на вируса на маймунската шарка за насочване на разработването на цялостни антивирусни средства

В скорошно проучване, публикувано в bioRxiv * Предварителен сървър: Изследователите изследваха кристалната структура на вируса на маймунската шарка (MPX) (MPXV) и комплекса от VP39, 2'-O-RNA метилтрансфераза (MTase), и синефунгин, инхибитор на пан-MTase.

Studie: Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. Bildnachweis: Marina Demidiuk/Shutterstock

Тази новинарска статия беше преглед на предварителен научен доклад, който не е бил рецензиран от партньори към момента на публикуването. От първоначалното си публикуване научният доклад вече е рецензиран и приет за публикуване в академично списание. Връзки към предварителните и рецензирани доклади могат да бъдат намерени в раздела Източници в края на тази статия. Вижте източниците

Броят на случаите на MPX нараства всеки час в световен мащаб и може да означава нова пандемия. Структурният анализ на MPXV може да бъде полезен при разработването на ефективни антивирусни средства за борба с MPXV. Поксвирусите кодират ензими от декапиращ тип, за да предотвратят натрупването на двойноверижна рибонуклеинова киселина (dsRNA) по време на инфекция, което може да предизвика вродени антивирусни имунни отговори. MPXV кодира покс ензима, който инхибира пътя на cGAS-STING (цикличен GMP-AMP синтазен стимулатор на интерферонови гени), задействан от ds-дезоксирибонуклеинова киселина (dsDNA).

Документирано е метилиране на първоначалния нуклеотид (nt) на зрялата MPXV капачка (или капачка-1) в 2'-О-рибозна позиция. MTase се изисква от семейството вируси Poxviridiae (включително MPXV) за синтеза на cap-0 и чрез добавяне на друга метилова група в 2'-O позиция на проксималната рибоза, незрелият cap (cap-0) може да бъде превърнат в зрял cap. Стъпката е важна за предотвратяване на развитието на вродени имунни отговори и се катализира от VP39, 2'-O MTase на MPXV.

Относно изследването

В настоящото проучване изследователите изследват структурата на комплекса VP39-синефунгин на MPXV, за да подобрят разбирането на механизмите на инхибиране на молекулата VP39 от синефунгин. Те също така сравняват структурата с 2'-O-MTases от едноверижни РНК вируси (ssRNA) като вируса Zika и коронавирус 2 на тежкия остър респираторен синдром (SARS-CoV-2).

Генът VP39 на щама MPXV USA-May22 беше кодонно оптимизиран за експресия в Е. coli за последващ синтез и клониране. Е. coli BL21 клетки се трансформират с VP39-експресиращ плазмид и се добавя IPTG (изопропил-bD-тиогалактопиранозид), последвано от пречистване на рекомбинантния VP39. Клетките се центрофугират, лизират и лизатът се подлага на хроматографски анализ. VP39 беше концентриран и смесен със синефунгин за експерименти, базирани на кристализация.

Първоначално образуваните кристали се раздробяват и зародишни сита и РНК субстрати се приготвят чрез in vitro транскрипция. Впоследствие бяха извършени 2´-O-MTase анализи и анализи с ехомасспектрометрия. Бяха определени скоростта на активност на МТаза, инхибиране на 2'-О-МТаза от синефунгин и скорости на преобразуване на субстрата (SAM) и бяха определени стойностите на полумаксималната инхибиторна концентрация (IC50).

Кристалографският набор от данни на получените дифракционни кристали беше анализиран. Структурните характеристики на комплекса VP39/синефунгин бяха изследвани с помощта на метода на молекулярно заместване със структурата на комплекса VP39/SAH на вируса на ваксиния като модел за търсене. За да се изследва ензимната активност на рекомбинантен VP39, бяха тествани два субстрата с различни предпоследни бази (m7GpppA РНК и m7GpppG РНК).

Взаимодействията VP39-синефунгин бяха анализирани чрез изграждане на модел на комплекса синефунгин:РНК:VP39, за да се илюстрират молекулярните механизми, лежащи в основата на инхибирането на VP39 от синефунгин. В допълнение, каталитичните места на VP39 бяха сравнени с тези на 2′-O-рибоза МТази от отдалечени вируси Zika и SARS-CoV-2.

Резултати

MPX структурата се състои от гънка на Росман, подобна на алфа/бета гънка (α/β), с централно разположен β-лист, обхващащ β2-β10 в модел, наподобяващ буквата J. Трябва да се отбележи, че моделът беше открит и за неструктурния протеин 2′-O MTase (nsp)1614 на SARS-CoV-2. Централният β-лист беше прикрепен в единия край от алфа-1, алфа2, алфа-6 и алфа-7 спирали, а в другия край от алфа-3 и алфа-7 спирали, а страните бяха свързани с β1. β11 и α5.

Установено е, че и двата RNAS субстрата са приемливи; обаче този с предпоследна гуанинова основа беше за предпочитане. Синефунгин инхибира VP39 с IC50 стойност от 41 µM. Установено е, че синефунгин заема джоба на SAM със своята аденинова основна част, разположена в дълбок каньон, облицован от свързани с водород хидрофобни странични вериги на остатъците Val116, Phe115, Leu159 и Val139. Синефунгин ефективно защитава 2'-О-рибозния регион с неговите аминогрупи близо до 2'-рибозния регион, където иначе би се намирал серният атом на SAM.

Проломът на SAM имаше два края, от които единият край, съседен на джоба на РНК, беше от решаващо значение за позиционирането на SAM за метилтрансферазни реакции, а противоположният край, разположен до адениновата база на синефунгин, беше незает. По-внимателна инспекция разкри сложна мрежа от водни молекули на мястото, свързани с водородни връзки и свързани с остатъци Glu118, Asn156 и Val116, както и с адениновата част.

Молекулите на скелето на синефунгин с части, които могат да изместят водните молекули и да взаимодействат директно с остатъците Glu118, Asn156 и Val116, могат да бъдат изключително добри свързващи вещества, тъй като изместването на водните молекули може да доведе до благоприятни ентропийни ефекти. Сходството на мястото на свързване на MPXV SAM със Zika и SARS-CoV-2 беше поразително. Наблюдавани са идентични конформации между синефунгин и протеините NS5, nsp16 и VP39 съответно на Zika, SARS-CoV-2 и MPXV.

Тетрадата на каталитичния остатък (Asp138, Lys41, Glu218 и Lys175) за MPXV беше запазена сред трите тествани отдалечени вируса, включително конформациите на остатъците. В допълнение, всички вируси са използвали остатък от аспартат, за да взаимодействат с аминогрупата на синефунгин. Запазените режими на свързване между трите вируса предполагат, че един инхибитор на MTase може потенциално да се използва като пан-антивирусно средство. Въпреки това се наблюдават разлики в начините на свързване на нуклеобазите и рибозния пръстен.

Като цяло, резултатите от проучването показват, че базираните на MTase инхибитори могат да бъдат пан-антивирусни цели.

Тази новинарска статия беше преглед на предварителен научен доклад, който не е бил рецензиран от партньори към момента на публикуването. От първоначалното си публикуване научният доклад вече е рецензиран и приет за публикуване в академично списание. Връзки към предварителните и рецензирани доклади могат да бъдат намерени в раздела Източници в края на тази статия. Вижте източниците

препратки:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Jan Silhan, Martin Klima, Dominika Chalupska, Jan Kozic, Evzen Boura. (2022). Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.27.509668 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.27.509668v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Silhan, Jan, Martin Klima, Tomas Otava, Petr Skvara, Dominika Chalupska, Karel Chalupsky, Jan Kozic, Radim Nencka und Evzen Boura. 2023. „Entdeckung und strukturelle Charakterisierung von Monkeypox-Virus-Methyltransferase-VP39-Inhibitoren zeigen Ähnlichkeiten mit SARS-CoV-2-Nsp14-Methyltransferase.“ Naturkommunikation 14 (1). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38019-1. https://www.nature.com/articles/s41467-023-38019-1.

Ревизии на статиите

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.