Strukturální analýza viru opičích neštovic k vedení vývoje komplexních antivirových látek

Strukturální analýza viru opičích neštovic k vedení vývoje komplexních antivirových látek

V nedávné studii publikované v bioRxiv * Předtiskový server: Výzkumníci zkoumali krystalickou strukturu viru opičích neštovic (MPX) (MPXV) a komplex VP39, 2'-O-RNA methyltransferázy (MTase), a sinefunginu, inhibitoru pan-MTázy.

Studie: Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. Bildnachweis: Marina Demidiuk/Shutterstock

Tento zpravodajský článek byl recenzí předběžné vědecké zprávy, která nebyla v době publikace recenzována. Od svého prvního zveřejnění byla vědecká zpráva nyní recenzována a přijata k publikaci v akademickém časopise. Odkazy na předběžné a recenzované zprávy naleznete v části Zdroje na konci tohoto článku. Zobrazit zdroje

Počet případů MPX se celosvětově každou hodinu zvyšuje a mohl by naznačovat novou pandemii. Strukturální analýza MPXV by mohla být užitečná při vývoji účinných antivirových látek pro boj s MPXV. Poxviry kódují enzymy typu decapping, aby zabránily akumulaci dvouvláknové ribonukleové kyseliny (dsRNA) během infekce, která by mohla spustit vrozené antivirové imunitní reakce. MPXV kóduje enzym pox, který inhibuje dráhu cGAS-STING (cyklický stimulátor GMP-AMP syntázy interferonových genů) spouštěnou ds-deoxyribonukleovou kyselinou (dsDNA).

Byla dokumentována methylace počátečního nukleotidu (nt) zralé čepičky MPXV (nebo čepičky-1) v poloze 2'-O-ribózy. MTáza je vyžadována rodinou virů Poxviridiae (včetně MPXV) pro syntézu cap-0 a přidáním další methylové skupiny na pozici 2'-O proximální ribózy může být nezralá čepička (cap-0) přeměněna na zralou čepičku. Tento krok je důležitý pro prevenci rozvoje vrozených imunitních odpovědí a je katalyzován VP39, 2'-O MTázou MPXV.

O studiu

V této studii výzkumníci zkoumali strukturu komplexu VP39-sinefungin MPXV, aby zlepšili pochopení mechanismů inhibice molekuly VP39 sinefunginem. Také porovnávali strukturu s 2'-O-MTázami z jednořetězcových RNA virů (ssRNA), jako je virus Zika a koronavirus těžkého akutního respiračního syndromu 2 (SARS-CoV-2).

Gen VP39 kmene MPXV USA-May22 byl kodonově optimalizován pro expresi v E. coli pro následnou syntézu a klonování. Buňky E. coli BL21 byly transformovány plazmidem exprimujícím VP39 a byl přidán IPTG (isopropyl-bD-thiogalaktopyranosid) a následovala purifikace rekombinantního VP39. Buňky byly odstředěny, lyžovány a lyzát byl podroben chromatografické analýze. VP39 byl koncentrován a smíchán se sinefunginem pro experimenty založené na krystalizaci.

Původně vytvořené krystaly byly rozdrceny a in vitro transkripcí byly připraveny očkovací síta a RNA substráty. Následně byly provedeny analýzy 2´-O-MTázy a analýzy echo hmotnostní spektrometrií. Byla stanovena rychlost aktivity MTázy, inhibice 2'-O-MTázy sinefunginem a rychlost konverze substrátu (SAM) a byly stanoveny hodnoty poloviční maximální inhibiční koncentrace (IC50).

Byl analyzován soubor krystalografických dat získaných difrakčních krystalů. Strukturní rysy komplexu VP39/sinefungin byly zkoumány pomocí metody molekulární substituce se strukturou komplexu viru vakcínie VP39/SAH jako vyhledávacím modelem. Pro zkoumání enzymatické aktivity rekombinantního VP39 byly testovány dva substráty s různými předposledními bázemi (m7GpppA RNA a m7GpppG RNA).

Interakce VP39-sinefungin byly analyzovány vytvořením modelu komplexu sinefungin:RNA:VP39 pro ilustraci molekulárních mechanismů, které jsou základem inhibice VP39 sinefunginem. Kromě toho byla katalytická místa VP39 porovnána s místy 2'-O-ribózových MTáz ze vzdálených virů Zika a SARS-CoV-2.

Výsledky

Struktura MPX obsahovala Rossmanův sklad podobný alfa/beta skladu (α/β), s centrálně umístěným β-listem překlenujícím β2-β10 ve vzoru připomínajícím písmeno J. Je pozoruhodné, že vzor byl také nalezen pro 2'-O MTase nestrukturální protein (nsp) 1614 SARS-CoV-2. Centrální β-list byl připojen na jednom konci pomocí alfa-1, alfa2, alfa-6 a alfa-7 šroubovice a na druhém konci pomocí alfa-3 a alfa-7 šroubovice a strany byly spojeny pomocí P1. β11 a α5.

Bylo zjištěno, že oba substráty RNAS jsou přijatelné; preferován byl však ten s předposledním guaninovým základem. Sinefungin inhiboval VP39 s hodnotou IC50 41 uM. Bylo zjištěno, že sinefungin obsazuje kapsu SAM se svou adeninovou bází umístěnou v hlubokém kaňonu lemovaném hydrofobními postranními řetězci zbytků Val116, Phe115, Leu159 a Val139 vázanými vodíkovými vazbami. Sinefungin účinně chránil oblast 2'-O-ribózy svými aminoskupinami v blízkosti oblasti 2'-ribózy, kde by se jinak nacházel atom síry SAM.

Soutěska SAM měla dva konce, z nichž jeden konec, sousedící s kapsou RNA, byl rozhodující pro umístění SAM pro methyltransferázové reakce, a opačný konec, umístěný vedle adeninové báze sinefunginu, byl neobsazený. Bližší prozkoumání odhalilo složitou síť molekul vody v místě, spojených vodíkovými vazbami a vázaných na zbytky Glu118, Asn156 a Val116 a také na adeninovou část.

Molekuly skeletu sinefunginu se skupinami, které by mohly vytěsnit molekuly vody a interagovat přímo se zbytky Glu118, Asn156 a Val116, by mohly být výjimečně dobrými pojivy, protože vytěsnění molekul vody by mohlo mít příznivé entropické účinky. Podobnost vazebného místa MPXV SAM se Zika a SARS-CoV-2 byla nápadná. Identické konformace byly pozorovány mezi sinefunginem a proteiny NS5, nsp16 a VP39 Zika, SARS-CoV-2 a MPXV, v daném pořadí.

Katalytický zbytek tetrad (Asp138, Lys41, Glu218 a Lys175) pro MPXV byl konzervován mezi třemi testovanými vzdálenými viry, včetně konformací zbytků. Kromě toho všechny viry využívaly aspartátový zbytek k interakci s aminoskupinou sinefunginu. Konzervované vazebné režimy mezi třemi viry naznačovaly, že jediný inhibitor MTázy by mohl být potenciálně použit jako pan-antivirové činidlo. Byly však pozorovány rozdíly ve vazebných režimech nukleobází a ribózového kruhu.

Celkově výsledky studie ukázaly, že inhibitory založené na MTase by mohly být pan-antivirovými cíli.

Tento zpravodajský článek byl recenzí předběžné vědecké zprávy, která nebyla v době publikace recenzována. Od svého prvního zveřejnění byla vědecká zpráva nyní recenzována a přijata k publikaci v akademickém časopise. Odkazy na předběžné a recenzované zprávy naleznete v části Zdroje na konci tohoto článku. Zobrazit zdroje

Reference:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Jan Silhan, Martin Klima, Dominika Chalupska, Jan Kozic, Evzen Boura. (2022). Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.27.509668 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.27.509668v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Silhan, Jan, Martin Klima, Tomas Otava, Petr Skvara, Dominika Chalupska, Karel Chalupsky, Jan Kozic, Radim Nencka und Evzen Boura. 2023. „Entdeckung und strukturelle Charakterisierung von Monkeypox-Virus-Methyltransferase-VP39-Inhibitoren zeigen Ähnlichkeiten mit SARS-CoV-2-Nsp14-Methyltransferase.“ Naturkommunikation 14 (1). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38019-1. https://www.nature.com/articles/s41467-023-38019-1.

Revize článku

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.