Strukturel analyse af monkeypox virus til at guide udviklingen af ​​omfattende antivirale midler

Strukturel analyse af monkeypox virus til at guide udviklingen af ​​omfattende antivirale midler

I en nylig undersøgelse offentliggjort i bioRxiv * Preprint-server: Forskere undersøgte den krystallinske struktur af abekoppevirus (MPX) (MPXV) og komplekset af VP39, en 2'-O-RNA-methyltransferase (MTase) og sinefungin, en pan-MTase-hæmmer.

Studie: Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. Bildnachweis: Marina Demidiuk/Shutterstock

Denne nyhedsartikel var en gennemgang af en foreløbig videnskabelig rapport, der ikke var blevet peer-reviewed på tidspunktet for offentliggørelsen. Siden den første udgivelse er den videnskabelige rapport nu blevet peer-reviewet og accepteret til offentliggørelse i et akademisk tidsskrift. Links til de foreløbige og peer-reviewede rapporter kan findes i afsnittet Kilder i slutningen af ​​denne artikel. Se kilder

Antallet af MPX-tilfælde stiger hver time på verdensplan og kan indikere en ny pandemi. Strukturel analyse af MPXV kan være nyttig til at udvikle effektive antivirale midler til at bekæmpe MPXV. Poxvirus koder for enzymer af decapping-typen for at forhindre akkumulering af dobbeltstrenget ribonukleinsyre (dsRNA) under infektion, hvilket kan udløse medfødte antivirale immunresponser. MPXV koder for pox-enzymet, som hæmmer cGAS-STING (cyklisk GMP-AMP-syntasestimulator af interferon-gener), som udløses af ds-deoxyribonukleinsyre (dsDNA).

Methylering af det indledende nukleotid (nt) af den modne MPXV-hætte (eller cap-1) ved 2'-O-ribose-positionen blev dokumenteret. MTase er påkrævet af Poxviridiae-virusfamilien (inklusive MPXV) til cap-0-syntese, og ved at tilføje en anden methylgruppe i 2'-O-positionen af ​​den proksimale ribose kan den umodne cap (cap-0) omdannes til den modne cap. Trinet er vigtigt for at forhindre udviklingen af ​​medfødte immunresponser og katalyseres af VP39, 2'-O MTase af MPXV.

Om studiet

I denne undersøgelse undersøgte forskere VP39-sinefungin-kompleksstrukturen af ​​MPXV for at forbedre forståelsen af ​​mekanismerne for inhibering af VP39-molekylet af sinefungin. De sammenlignede også strukturen med 2′-O-MTaser fra enkeltstrengede RNA-vira (ssRNA) såsom Zika-virus og alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2).

VP39-genet fra MPXV USA-May22-stammen blev kodonoptimeret til ekspression i E. coli til efterfølgende syntese og kloning. E. coli BL21-celler blev transformeret med VP39-udtrykkende plasmid, og IPTG (isopropyl-bD-thiogalactopyranosid) blev tilsat, efterfulgt af oprensning af det rekombinante VP39. Cellerne blev centrifugeret, lyseret, og lysatet blev underkastet kromatografisk analyse. VP39 blev koncentreret og blandet med sinefungin til krystallisationsbaserede eksperimenter.

De oprindeligt dannede krystaller blev knust, og frøsigter og RNA-substrater blev fremstillet ved in vitro-transkription. Efterfølgende blev 2'-O-MTase-assays og ekkomassespektrometri-analyser udført. Hastigheden af ​​MTase-aktivitet, 2'-O-MTase-hæmning af sinefungin og substratomdannelseshastigheder (SAM) blev bestemt, og de halvmaksimale inhiberende koncentrationsværdier (IC50) blev bestemt.

Det krystallografiske datasæt af de opnåede diffraktionskrystaller blev analyseret. De strukturelle træk ved VP39/sinefungin-komplekset blev undersøgt ved anvendelse af den molekylære substitutionsmetode med vacciniavirus VP39/SAH-kompleksstrukturen som en søgemodel. For at undersøge den enzymatiske aktivitet af rekombinant VP39 blev to substrater med forskellige næstsidste baser (m7GpppA RNA og m7GpppG RNA) testet.

VP39-sinefungin-interaktionerne blev analyseret ved at bygge en model af sinefungin:RNA:VP39-komplekset for at illustrere de molekylære mekanismer, der ligger til grund for VP39-hæmning af sinefungin. Derudover blev de katalytiske steder for VP39 sammenlignet med dem for 2'-O-ribose MTaser fra fjerne Zika-vira og SARS-CoV-2.

Resultater

MPX-strukturen omfattede en Rossman-fold svarende til alfa/beta-folden (α/β), med det centralt placerede β-ark, der spænder over β2-β10 i et mønster, der ligner J-bogstavet. Navnlig blev mønsteret også fundet for 2'-O MTase ikke-strukturelt protein (nsp)1614 af SARS-CoV-2. Det centrale β-ark blev fastgjort i den ene ende af alpha-1, alpha2, alpha-6 og alpha-7 helixer og i den anden ende af alpha-3 og alpha-7 helixerne, og siderne var forbundet med β1. β11 og α5.

Begge RNAS-substrater blev fundet at være acceptable; dog var den med næstsidste guaninbase at foretrække. Sinefungin hæmmede VP39 med en IC50-værdi på 41 µM. Sinefungin viste sig at optage SAM-lommen med dens adenin-basedel placeret i en dyb canyon foret med hydrogenbundne hydrofobe sidekæder af Val116-, Phe115-, Leu159- og Val139-resterne. Sinefungin beskyttede effektivt 2'-O-ribose-regionen med dens aminogrupper nær 2'-ribose-regionen, hvor svovlatomet i SAM ellers ville være placeret.

SAM-kløften havde to ender, hvoraf den ene ende, støder op til RNA-lommen, var afgørende for positionering af SAM til methyltransferase-reaktioner, og den modsatte ende, placeret ved siden af ​​adeninbasen af ​​sinefungin, var ubesat. Nærmere inspektion afslørede et komplekst netværk af vandmolekyler på stedet, forbundet med hydrogenbindinger og bundet til resterne Glu118, Asn156 og Val116 samt adenin-delen.

Sinefungin stilladsmolekyler med dele, der kunne fortrænge vandmolekylerne og interagere direkte med Glu118-, Asn156- og Val116-resterne, kunne være usædvanligt gode bindemidler, fordi forskydningen af ​​vandmolekylerne kunne producere gunstige entropiske effekter. Ligheden mellem MPXV SAM-bindingsstedet med Zika og SARS-CoV-2 var slående. Identiske konformationer blev observeret mellem sinefungin og NS5-, nsp16- og VP39-proteinerne af henholdsvis Zika, SARS-CoV-2 og MPXV.

Den katalytiske rest-tetrad (Asp138, Lys41, Glu218 og Lys175) for MPXV blev konserveret blandt de tre fjerntliggende vira, der blev testet, inklusive restkonformationerne. Derudover brugte alle vira en aspartatrest til at interagere med aminogruppen af ​​sinefungin. De bevarede bindingsmåder mellem de tre vira antydede, at en enkelt MTase-hæmmer potentielt kunne anvendes som et pan-antiviralt middel. Forskelle i nukleobasernes og riboseringens bindingsmåder blev imidlertid observeret.

Samlet set viste undersøgelsesresultaterne, at MTase-baserede hæmmere kunne være pan-antivirale mål.

Denne nyhedsartikel var en gennemgang af en foreløbig videnskabelig rapport, der ikke var blevet peer-reviewed på tidspunktet for offentliggørelsen. Siden den første udgivelse er den videnskabelige rapport nu blevet peer-reviewet og accepteret til offentliggørelse i et akademisk tidsskrift. Links til de foreløbige og peer-reviewede rapporter kan findes i afsnittet Kilder i slutningen af ​​denne artikel. Se kilder

Referencer:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Jan Silhan, Martin Klima, Dominika Chalupska, Jan Kozic, Evzen Boura. (2022). Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.27.509668 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.27.509668v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Silhan, Jan, Martin Klima, Tomas Otava, Petr Skvara, Dominika Chalupska, Karel Chalupsky, Jan Kozic, Radim Nencka und Evzen Boura. 2023. „Entdeckung und strukturelle Charakterisierung von Monkeypox-Virus-Methyltransferase-VP39-Inhibitoren zeigen Ähnlichkeiten mit SARS-CoV-2-Nsp14-Methyltransferase.“ Naturkommunikation 14 (1). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38019-1. https://www.nature.com/articles/s41467-023-38019-1.

Artikel revisioner

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.