Δομική ανάλυση του ιού της ευλογιάς των πιθήκων για την καθοδήγηση της ανάπτυξης ολοκληρωμένων αντιιικών παραγόντων

Δομική ανάλυση του ιού της ευλογιάς των πιθήκων για την καθοδήγηση της ανάπτυξης ολοκληρωμένων αντιιικών παραγόντων

Σε πρόσφατη μελέτη που δημοσιεύτηκε στο bioRxiv * Διακομιστής προεκτύπωσης: Οι ερευνητές εξέτασαν την κρυσταλλική δομή του ιού της ευλογιάς των πιθήκων (MPX) (MPXV) και το σύμπλεγμα VP39, μιας μεθυλτρανσφεράσης 2'-O-RNA (MTase) και σινεφουνγκίνης, ενός αναστολέα παν-ΜΤάσης.

Studie: Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. Bildnachweis: Marina Demidiuk/Shutterstock

Αυτό το άρθρο ειδήσεων ήταν μια ανασκόπηση μιας προκαταρκτικής επιστημονικής έκθεσης που δεν είχε αξιολογηθεί από ομοτίμους κατά τη στιγμή της δημοσίευσης. Από την αρχική της δημοσίευση, η επιστημονική έκθεση έχει πλέον αξιολογηθεί από ομοτίμους και έγινε αποδεκτή για δημοσίευση σε ακαδημαϊκό περιοδικό. Μπορείτε να βρείτε συνδέσμους για τις προκαταρκτικές αναφορές και τις αναφορές με αξιολόγηση από ομοτίμους στην ενότητα Πηγές στο τέλος αυτού του άρθρου. Προβολή πηγών

Ο αριθμός των κρουσμάτων MPX αυξάνεται κάθε ώρα παγκοσμίως και μπορεί να υποδηλώνει νέα πανδημία. Η δομική ανάλυση του MPXV θα μπορούσε να είναι χρήσιμη για την ανάπτυξη αποτελεσματικών αντιιικών παραγόντων για την καταπολέμηση του MPXV. Οι ιοί ευλογιάς κωδικοποιούν ένζυμα τύπου αποκάλυψης για να αποτρέψουν τη συσσώρευση δίκλωνου ριβονουκλεϊκού οξέος (dsRNA) κατά τη διάρκεια της μόλυνσης, το οποίο θα μπορούσε να προκαλέσει εγγενείς αντιικές ανοσολογικές αποκρίσεις. Το MPXV κωδικοποιεί το ένζυμο ευλογιάς, το οποίο αναστέλλει το μονοπάτι cGAS-STING (κυκλικός διεγέρτης συνθάσης GMP-AMP των γονιδίων ιντερφερόνης) που ενεργοποιείται από το ds-δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (dsDNA).

Τεκμηριώθηκε η μεθυλίωση του αρχικού νουκλεοτιδίου (nt) του ώριμου καλύμματος MPXV (ή του cap-1) στη θέση 2'-Ο-ριβόζης. Η MTase απαιτείται από την οικογένεια ιών Poxviridiae (συμπεριλαμβανομένου του MPXV) για τη σύνθεση του cap-0 και με την προσθήκη μιας άλλης μεθυλομάδας στη θέση 2'-O της εγγύς ριβόζης, το ανώριμο καπάκι (cap-0) μπορεί να μετατραπεί στο ώριμο καπάκι. Το βήμα είναι σημαντικό για την πρόληψη της ανάπτυξης εγγενών ανοσολογικών αποκρίσεων και καταλύεται από την VP39, την 2'-O MTase του MPXV.

Σχετικά με τη μελέτη

Στην παρούσα μελέτη, οι ερευνητές εξέτασαν τη σύνθετη δομή VP39-sinefungin του MPXV για να βελτιώσουν την κατανόηση των μηχανισμών αναστολής του μορίου VP39 από τη sinefungin. Συνέκριναν επίσης τη δομή με 2'-Ο-ΜΤάσες από μονόκλωνους ιούς RNA (ssRNA) όπως ο ιός Ζίκα και το σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο κοροναϊός 2 (SARS-CoV-2).

Το γονίδιο VP39 του στελέχους MPXV USA-May22 βελτιστοποιήθηκε με κωδικόνιο για έκφραση σε Ε. coli για επακόλουθη σύνθεση και κλωνοποίηση. Κύτταρα Ε. coli BL21 μετασχηματίστηκαν με πλασμίδιο που εκφράζει VP39 και προστέθηκε IPTG (ισοπροπυλ-bD-θειογαλακτοπυρανοσίδη), ακολουθούμενο από καθαρισμό του ανασυνδυασμένου VP39. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν, λύθηκαν και το προϊόν λύσης υποβλήθηκε σε χρωματογραφική ανάλυση. Το VP39 συμπυκνώθηκε και αναμίχθηκε με σινεφουνγκίνη για πειράματα με βάση την κρυστάλλωση.

Οι αρχικά σχηματισμένοι κρύσταλλοι συνθλίβονται και παρασκευάζονται κόσκινα σπόρων και υποστρώματα RNA με μεταγραφή in vitro. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις 2'-Ο-ΜΤάσης και αναλύσεις φασματομετρίας μάζας ηχούς. Προσδιορίστηκαν ο ρυθμός δραστικότητας ΜΤάσης, η αναστολή της 2'-Ο-ΜΤάσης από τη σινεφουγκίνη και οι ρυθμοί μετατροπής υποστρώματος (SAM) και προσδιορίστηκαν οι τιμές ημι-μέγιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (IC50).

Το σύνολο κρυσταλλογραφικών δεδομένων των ληφθέντων κρυστάλλων περίθλασης αναλύθηκε. Τα δομικά χαρακτηριστικά του συμπλόκου VP39/sinefungin εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο μοριακής υποκατάστασης με τη δομή συμπλόκου του ιού δαμαλίτιδας VP39/SAH ως μοντέλο αναζήτησης. Για να εξεταστεί η ενζυματική δραστικότητα του ανασυνδυασμένου VP39, δοκιμάστηκαν δύο υποστρώματα με διαφορετικές προτελευταίες βάσεις (m7GpppA RNA και m7GpppG RNA).

Οι αλληλεπιδράσεις VP39-sinefungin αναλύθηκαν δημιουργώντας ένα μοντέλο του συμπλέγματος sinefungin:RNA:VP39 για την απεικόνιση των μοριακών μηχανισμών στους οποίους βασίζεται η αναστολή VP39 από τη sinefungin. Επιπλέον, οι καταλυτικές θέσεις του VP39 συγκρίθηκαν με αυτές των MTases 2'-O-ριβόζης από απομακρυσμένους ιούς Zika και SARS-CoV-2.

Αποτελέσματα

Η δομή MPX περιλάμβανε μια πτυχή Rossman παρόμοια με την πτυχή άλφα/βήτα (α/β), με το κεντρικά τοποθετημένο β-φύλλο να εκτείνεται σε β2-β10 σε ένα σχέδιο που μοιάζει με το γράμμα J. Συγκεκριμένα, το πρότυπο βρέθηκε επίσης για τη μη δομική πρωτεΐνη 2'-O MTase (nsp)1614 του SARS-CoV-2. Το κεντρικό β-φύλλο συνδέθηκε στο ένα άκρο με έλικες άλφα-1, άλφα2, άλφα-6 και άλφα-7 και στο άλλο άκρο με τις έλικες άλφα-3 και άλφα-7 και οι πλευρές συνδέθηκαν με β1. β11 και α5.

Και τα δύο υποστρώματα RNA βρέθηκαν ότι είναι αποδεκτά. προτιμότερο όμως ήταν αυτό με προτελευταία βάση γουανίνης. Το Sinefungin ανέστειλε το VP39 με τιμή IC50 41 μΜ. Το Sinefungin βρέθηκε ότι καταλαμβάνει τον θύλακα SAM με το τμήμα βάσης αδενίνης του που βρίσκεται σε ένα βαθύ φαράγγι που είναι επενδεδυμένο με υδρόφοβες πλευρικές αλυσίδες των υπολειμμάτων Val116, Phe115, Leu159 και Val139. Το Sinefungin προστάτευσε αποτελεσματικά την περιοχή 2'-O-ριβόζης με τις αμινομάδες της κοντά στην περιοχή 2'-ριβόζης όπου διαφορετικά θα βρισκόταν το άτομο θείου του SAM.

Το φαράγγι SAM είχε δύο άκρα, από τα οποία το ένα άκρο, δίπλα στον θύλακα RNA, ήταν κρίσιμο για την τοποθέτηση του SAM για αντιδράσεις μεθυλοτρανσφεράσης και το αντίθετο άκρο, που βρισκόταν δίπλα στη βάση αδενίνης της σινεφουνγκίνης, ήταν άδειο. Η πιο προσεκτική επιθεώρηση αποκάλυψε ένα πολύπλοκο δίκτυο μορίων νερού στην τοποθεσία, συνδεδεμένα με δεσμούς υδρογόνου και συνδεδεμένα με τα υπολείμματα Glu118, Asn156 και Val116 καθώς και με το τμήμα αδενίνης.

Μόρια ικριώματος Sinefungin με τμήματα που θα μπορούσαν να εκτοπίσουν τα μόρια του νερού και να αλληλεπιδράσουν άμεσα με τα υπολείμματα Glu118, Asn156 και Val116 θα μπορούσαν να είναι εξαιρετικά καλά συνδετικά επειδή η μετατόπιση των μορίων του νερού θα μπορούσε να παράγει ευνοϊκά εντροπικά αποτελέσματα. Η ομοιότητα της θέσης δέσμευσης MPXV SAM με τον Zika και τον SARS-CoV-2 ήταν εντυπωσιακή. Παρόμοιες διαμορφώσεις παρατηρήθηκαν μεταξύ του sinefungin και των πρωτεϊνών NS5, nsp16 και VP39 των Zika, SARS-CoV-2 και MPXV, αντίστοιχα.

Η τετραάδα καταλυτικού υπολείμματος (Asp138, Lys41, Glu218 και Lys175) για MPXV διατηρήθηκε μεταξύ των τριών απομακρυσμένων ιών που δοκιμάστηκαν, συμπεριλαμβανομένων των διαμορφώσεων υπολειμμάτων. Επιπλέον, όλοι οι ιοί χρησιμοποίησαν ένα υπόλειμμα ασπαρτικού για να αλληλεπιδράσουν με την αμινομάδα της σινεφουγκίνης. Οι συντηρημένοι τρόποι δέσμευσης μεταξύ των τριών ιών υποδηλώνουν ότι ένας μεμονωμένος αναστολέας ΜΤάσης θα μπορούσε ενδεχομένως να χρησιμοποιηθεί ως παν-αντιϊκός παράγοντας. Ωστόσο, παρατηρήθηκαν διαφορές στους τρόπους δέσμευσης των νουκλεοβάσεων και του δακτυλίου ριβόζης.

Συνολικά, τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι οι αναστολείς που βασίζονται στη ΜΤάση θα μπορούσαν να είναι παν-αντιικοί στόχοι.

Αυτό το άρθρο ειδήσεων ήταν μια ανασκόπηση μιας προκαταρκτικής επιστημονικής έκθεσης που δεν είχε αξιολογηθεί από ομοτίμους κατά τη στιγμή της δημοσίευσης. Από την αρχική της δημοσίευση, η επιστημονική έκθεση έχει πλέον αξιολογηθεί από ομοτίμους και έγινε αποδεκτή για δημοσίευση σε ακαδημαϊκό περιοδικό. Μπορείτε να βρείτε συνδέσμους για τις προκαταρκτικές αναφορές και τις αναφορές με αξιολόγηση από ομοτίμους στην ενότητα Πηγές στο τέλος αυτού του άρθρου. Προβολή πηγών

Παραπομπές:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Jan Silhan, Martin Klima, Dominika Chalupska, Jan Kozic, Evzen Boura. (2022). Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.27.509668 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.27.509668v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Silhan, Jan, Martin Klima, Tomas Otava, Petr Skvara, Dominika Chalupska, Karel Chalupsky, Jan Kozic, Radim Nencka und Evzen Boura. 2023. „Entdeckung und strukturelle Charakterisierung von Monkeypox-Virus-Methyltransferase-VP39-Inhibitoren zeigen Ähnlichkeiten mit SARS-CoV-2-Nsp14-Methyltransferase.“ Naturkommunikation 14 (1). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38019-1. https://www.nature.com/articles/s41467-023-38019-1.

Αναθεωρήσεις άρθρου

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.