Ahvirõugete viiruse struktuurianalüüs, et juhtida kõikehõlmavate viirusevastaste ainete väljatöötamist

Ahvirõugete viiruse struktuurianalüüs, et juhtida kõikehõlmavate viirusevastaste ainete väljatöötamist

Hiljutises uuringus, mis avaldati aastal bioRxiv * Preprintserver: teadlased uurisid ahvirõugete viiruse (MPX) (MPXV) kristalset struktuuri ja VP39, 2'-O-RNA metüültransferaasi (MTase) ja pan-MTaasi inhibiitori sinefungiini kompleksi.

Studie: Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. Bildnachweis: Marina Demidiuk/Shutterstock

See uudisartikkel oli ülevaade esialgsest teaduslikust aruandest, mida avaldamise ajal ei olnud eelretsenseeritud. Alates selle esialgsest avaldamisest on teaduslikku aruannet nüüdseks eelretsenseeritud ja aktsepteeritud akadeemilises ajakirjas avaldamiseks. Lingid esialgsetele ja eelretsenseeritud aruannetele leiate selle artikli lõpus olevast jaotisest Allikad. Vaata allikaid

MPX-juhtumite arv kasvab maailmas iga tunniga ja võib viidata uuele pandeemiale. MPXV struktuurianalüüs võib olla abiks tõhusate viirusevastaste ainete väljatöötamisel MPXV vastu võitlemiseks. Rõugeviirused kodeerivad decapping-tüüpi ensüüme, et vältida kaheahelalise ribonukleiinhappe (dsRNA) akumuleerumist nakatumise ajal, mis võib vallandada kaasasündinud viirusevastase immuunvastuse. MPXV kodeerib rõugete ensüümi, mis inhibeerib cGAS-STING (interferooni geenide tsükliline GMP-AMP süntaasi stimulaator) rada, mille käivitab ds-desoksüribonukleiinhape (dsDNA).

Dokumenteeriti küpse MPXV cap (või cap-1) algse nukleotiidi (nt) metüülimine 2'-O-riboosi positsioonis. MTaasi vajab Poxviridiae viiruste perekond (sealhulgas MPXV) cap-0 sünteesiks ja teise metüülrühma lisamisega proksimaalse riboosi 2'-O asendisse saab ebaküpse korgi (cap-0) muuta küpseks korgiks. See samm on oluline kaasasündinud immuunvastuste tekke ärahoidmiseks ja seda katalüüsib VP39, MPXV 2'-O MTaas.

Uuringu kohta

Käesolevas uuringus uurisid teadlased MPXV VP39-sinefungiini kompleksset struktuuri, et paremini mõista sinefungiini poolt VP39 molekuli pärssimise mehhanisme. Nad võrdlesid struktuuri ka üheahelaliste RNA viiruste (ssRNA) 2'-O-MTaasidega, nagu Zika viirus ja raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviirus 2 (SARS-CoV-2).

MPXV USA-May22 tüve VP39 geen optimeeriti järgnevaks sünteesiks ja kloonimiseks E. coli-s ekspressiooniks. E. coli BL21 rakud transformeeriti VP39 ekspresseeriva plasmiidiga ja lisati IPTG (isopropüül-bD-tiogalaktopüranosiid), millele järgnes rekombinantse VP39 puhastamine. Rakud tsentrifuugiti, lüüsiti ja lüsaadiga tehti kromatograafilist analüüsi. VP39 kontsentreeriti ja segati kristallisatsioonipõhiste katsete jaoks sinefungiiniga.

Algselt moodustunud kristallid purustati ning in vitro transkriptsiooniga valmistati seemnesõelad ja RNA substraadid. Seejärel viidi läbi 2'-O-MTaasi testid ja kaja massispektromeetria analüüsid. Määrati MTaasi aktiivsuse kiirus, 2'-O-MTaasi inhibeerimine sinefungiini poolt ja substraadi konversioonikiirused (SAM) ning määrati poole maksimaalsest inhibeerivast kontsentratsioonist (IC50).

Analüüsiti saadud difraktsioonikristallide kristallograafilisi andmeid. VP39/sinefungiini kompleksi struktuurseid tunnuseid uuriti, kasutades otsingumudelina vaktsiiniaviiruse VP39/SAH kompleksstruktuuri kasutades molekulaarset asendusmeetodit. Rekombinantse VP39 ensümaatilise aktiivsuse uurimiseks testiti kahte erineva eelviimase alusega substraati (m7GpppA RNA ja m7GpppG RNA).

VP39-sinefungiini interaktsioone analüüsiti, luues sinefungiini:RNA:VP39 kompleksi mudeli, et illustreerida molekulaarseid mehhanisme, mis on aluseks VP39 inhibeerimisele sinefungiini poolt. Lisaks võrreldi VP39 katalüütilisi saite kaugete Zika viiruste ja SARS-CoV-2 2'-O-riboosi MTaasi omadega.

Tulemused

MPX-struktuur sisaldas Rossmani volti, mis sarnanes alfa-/beetavoldile (α / β), kusjuures keskel paiknev β-leht ulatub β2-β10 J-tähte meenutava mustriga. Eelkõige leiti see muster ka SARS-CoV-2 2'-O MTaasi mittestruktuurse valgu (nsp)1614 jaoks. Keskne β-leht kinnitati ühest otsast alfa-1, alfa2, alfa-6 ja alfa-7 spiraalidega ning teisest otsast alfa-3 ja alfa-7 heeliksiga ning küljed olid ühendatud β1-ga. β11 ja α5.

Mõlemad RNAS-i substraadid leiti olevat vastuvõetavad; eelistatud oli aga eelviimase guaniinibaasiga. Sinefungiin inhibeeris VP39 IC50 väärtusega 41 uM. Leiti, et sinefungiin hõivab SAM tasku koos adeniini aluse osaga, mis asub sügavas kanjonis, mida ääristavad Val116, Phe115, Leu159 ja Val139 jääkide vesiniksidemetega hüdrofoobsed külgahelad. Sinefungiin kaitses tõhusalt 2'-O-riboosi piirkonda oma aminorühmadega 2'-riboosi piirkonna lähedal, kus muidu asuks SAM-i väävliaatom.

SAM-i kurul oli kaks otsa, millest üks RNA taskuga külgnev ots oli ülioluline SAM-i positsioneerimiseks metüültransferaasi reaktsioonide jaoks ja vastaspool, mis asus sinefungiini adeniini aluse kõrval, oli hõivamata. Lähemal uurimisel ilmnes kohas keeruline veemolekulide võrgustik, mis on ühendatud vesiniksidemetega ja seotud jääkidega Glu118, Asn156 ja Val116, samuti adeniini osaga.

Sinefungiini karkassimolekulid, mille osad võivad veemolekule välja tõrjuda ja suhelda otse Glu118, Asn156 ja Val116 jääkidega, võivad olla erakordselt head sideained, kuna veemolekulide nihkumine võib tekitada soodsaid entroopilisi efekte. MPXV SAM-i sidumissaidi sarnasus Zika ja SARS-CoV-2-ga oli silmatorkav. Sinefungiini ja Zika, SARS-CoV-2 ja MPXV valkude NS5, nsp16 ja VP39 vahel täheldati identseid konformatsioone.

MPXV katalüütilise jäägi tetraad (Asp138, Lys41, Glu218 ja Lys175) säilitati kolme testitud kauge viiruse hulgas, sealhulgas jääkide konformatsioonid. Lisaks kasutasid kõik viirused sinefungiini aminorühmaga suhtlemiseks aspartaadi jääki. Kolme viiruse vahelised konserveerunud seondumisviisid viitasid sellele, et ühte MTaasi inhibiitorit võib potentsiaalselt kasutada viirusevastase ainena. Siiski täheldati erinevusi nukleoaluste ja riboositsükli seondumisviisides.

Üldiselt näitasid uuringu tulemused, et MTaasi-põhised inhibiitorid võivad olla viirusevastased sihtmärgid.

See uudisartikkel oli ülevaade esialgsest teaduslikust aruandest, mida avaldamise ajal ei olnud eelretsenseeritud. Alates selle esialgsest avaldamisest on teaduslikku aruannet nüüdseks eelretsenseeritud ja aktsepteeritud akadeemilises ajakirjas avaldamiseks. Lingid esialgsetele ja eelretsenseeritud aruannetele leiate selle artikli lõpus olevast jaotisest Allikad. Vaata allikaid

Viited:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Jan Silhan, Martin Klima, Dominika Chalupska, Jan Kozic, Evzen Boura. (2022). Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.27.509668 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.27.509668v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Silhan, Jan, Martin Klima, Tomas Otava, Petr Skvara, Dominika Chalupska, Karel Chalupsky, Jan Kozic, Radim Nencka und Evzen Boura. 2023. „Entdeckung und strukturelle Charakterisierung von Monkeypox-Virus-Methyltransferase-VP39-Inhibitoren zeigen Ähnlichkeiten mit SARS-CoV-2-Nsp14-Methyltransferase.“ Naturkommunikation 14 (1). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38019-1. https://www.nature.com/articles/s41467-023-38019-1.

Artiklite redaktsioonid

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.