Apinarokkoviruksen rakenneanalyysi ohjaamaan kattavien viruslääkkeiden kehittämistä

Apinarokkoviruksen rakenneanalyysi ohjaamaan kattavien viruslääkkeiden kehittämistä

Äskettäin julkaistussa tutkimuksessa bioRxiv * Preprint-palvelin: Tutkijat tutkivat apinapoxviruksen (MPX) (MPXV) kiteistä rakennetta ja VP39:n, 2'-O-RNA-metyylitransferaasin (MTase) ja sinefungiinin, pan-MTaasi-inhibiittorin, kompleksia.

Studie: Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. Bildnachweis: Marina Demidiuk/Shutterstock

Tämä uutisartikkeli oli katsaus alustavaan tieteelliseen raporttiin, jota ei ollut vertaisarvioitu julkaisuhetkellä. Alkuperäisen julkaisunsa jälkeen tieteellinen raportti on nyt vertaisarvioitu ja hyväksytty julkaistavaksi akateemisessa lehdessä. Linkit alustaviin ja vertaisarvioituihin raportteihin löytyvät tämän artikkelin lopun Lähteet-osiosta. Näytä lähteet

MPX-tapausten määrä kasvaa joka tunti maailmanlaajuisesti ja voi viitata uuteen pandemiaan. MPXV:n rakenneanalyysi voisi olla hyödyllinen kehitettäessä tehokkaita viruslääkkeitä MPXV:tä vastaan. Poxvirukset koodaavat decapping-tyyppisiä entsyymejä estämään kaksijuosteisen ribonukleiinihapon (dsRNA) kerääntymisen infektion aikana, mikä voi laukaista synnynnäisiä antiviraalisia immuunivasteita. MPXV koodaa pox-entsyymiä, joka estää ds-deoksiribonukleiinihapon (dsDNA) laukaiseman cGAS-STING-reitin (interferonigeenien syklinen GMP-AMP-syntaasistimulaattori).

Kypsän MPXV cap:n (tai cap-1) alkuperäisen nukleotidin (nt) metylaatio 2'-O-riboosiasemassa dokumentoitiin. Poxviridiae-virusperhe (mukaan lukien MPXV) vaatii MTaasia cap-0-synteesiin, ja lisäämällä toinen metyyliryhmä proksimaalisen riboosin 2'-O-kohtaan, kypsymätön cap (cap-0) voidaan muuttaa kypsäksi cap-soluksi. Vaihe on tärkeä synnynnäisten immuunivasteiden kehittymisen estämiseksi, ja sitä katalysoi VP39, MPXV:n 2'-O MTaasi.

Tietoja tutkimuksesta

Tässä tutkimuksessa tutkijat tutkivat MPXV:n VP39-sinefungiinikompleksirakennetta parantaakseen ymmärrystä sinefungiinin aiheuttamasta VP39-molekyylin estomekanismista. He myös vertasivat rakennetta yksijuosteisista RNA-viruksista (ssRNA) peräisin oleviin 2'-O-MTaaseihin, kuten Zika-virukseen ja vakavaan akuuttiin hengitystieoireyhtymään koronavirukseen 2 (SARS-CoV-2).

MPXV USA-May22 -kannan VP39-geeni kodoni optimoitiin ekspressiota varten E. colissa myöhempää synteesiä ja kloonausta varten. E. coli BL21 -solut transformoitiin VP39:ää ilmentävällä plasmidilla ja IPTG:tä (isopropyyli-bD-tiogalaktopyranosidi) lisättiin, mitä seurasi rekombinantti-VP39:n puhdistus. Solut sentrifugoitiin, lysoitiin ja lysaatille suoritettiin kromatografinen analyysi. VP39 konsentroitiin ja sekoitettiin sinefungiinin kanssa kiteytyspohjaisia ​​kokeita varten.

Aluksi muodostuneet kiteet murskattiin ja siemenseulat ja RNA-substraatit valmistettiin in vitro -transkriptiolla. Sen jälkeen suoritettiin 2'-O-MTase-määritykset ja kaikumassaspektrometria-analyysit. MTaasi-aktiivisuuden nopeus, sinefungiinin aiheuttama 2'-O-MTaasi-inhibitio ja substraattikonversionopeudet (SAM) määritettiin ja puolet maksimaalisesta estopitoisuudesta (IC50) määritettiin.

Saatujen diffraktiokiteiden kristallografiset tiedot analysoitiin. VP39/sinefungiinikompleksin rakenteellisia piirteitä tutkittiin käyttämällä molekyylisubstituutiomenetelmää, jossa hakumallina oli vacciniaviruksen VP39/SAH-kompleksirakenne. Rekombinantin VP39:n entsymaattisen aktiivisuuden tutkimiseksi testattiin kaksi substraattia, joissa oli eri toiseksi viimeinen emäs (m7GpppA RNA ja m7GpppG RNA).

VP39-sinefungiinin vuorovaikutuksia analysoitiin rakentamalla malli sinefungiini:RNA:VP39-kompleksista havainnollistamaan molekyylimekanismeja, jotka ovat sinefungiinin aiheuttaman VP39:n inhibition taustalla. Lisäksi VP39:n katalyyttisiä kohtia verrattiin kaukaisista Zika-viruksista ja SARS-CoV-2:sta peräisin olevien 2'-O-riboosin MTaasien katalyyttikohtiin.

Tulokset

MPX-rakenne käsitti Rossman-taioksen, joka oli samanlainen kuin alfa/beta-taitos (α/β), ja keskellä sijaitseva β-arkki ulottui β2-β10:een J-kirjainta muistuttavassa kuviossa. Erityisesti kuvio löydettiin myös SARS-CoV-2:n 2'-O MTaasi ei-rakenneproteiinille (nsp)1614. Keskimmäinen β-levy kiinnitettiin toisesta päästä alfa-1-, alfa2-, alfa-6- ja alfa-7-kierteillä ja toisesta päästä alfa-3- ja alfa-7-kierteillä, ja sivut yhdistettiin β1:llä. β11 ja α5.

Molemmat RNAS-substraatit havaittiin hyväksyttäviksi; kuitenkin se, jossa oli toiseksi viimeinen guaniinipohja, oli parempi. Sinefungiini esti VP39:ää IC50-arvolla 41 uM. Sinefungiinin havaittiin peittävän SAM-taskun adeniiniemäsosan ollessa syvässä kanjonissa, jota reunustavat Val116-, Phe115-, Leu159- ja Val139-tähteiden vetysidoksiset hydrofobiset sivuketjut. Sinefungiini suojasi tehokkaasti 2'-O-riboosialuetta aminoryhmillään lähellä 2'-riboosialuetta, jossa SAM:n rikkiatomi muuten sijaitsisi.

SAM-rotossa oli kaksi päätä, joista toinen pää, RNA-taskun vieressä, oli ratkaisevan tärkeä SAM:n sijoittamiseksi metyylitransferaasireaktioihin, ja vastakkainen pää, joka sijaitsee sinefungiinin adeniiniemäksen vieressä, oli vapaa. Tarkempi tarkastelu paljasti paikalla monimutkaisen vesimolekyyliverkoston, joka oli yhdistetty vetysidoksilla ja sitoutunut tähteisiin Glu118, Asn156 ja Val116 sekä adeniiniosaan.

Sinefungiinirunkomolekyylit, joissa on osia, jotka voisivat syrjäyttää vesimolekyylit ja olla vuorovaikutuksessa suoraan Glu118-, Asn156- ja Val116-tähteiden kanssa, voivat olla poikkeuksellisen hyviä sideaineita, koska vesimolekyylien syrjäytyminen voi tuottaa suotuisia entrooppisia vaikutuksia. MPXV SAM:n sitoutumiskohdan samankaltaisuus Zikan ja SARS-CoV-2:n kanssa oli silmiinpistävää. Sinefungiinin ja Zika-, SARS-CoV-2- ja MPXV-proteiinien NS5-, nsp16- ja VP39-proteiinien välillä havaittiin identtiset konformaatiot.

MPXV:n katalyyttisen jäännöstetradi (Asp138, Lys41, Glu218 ja Lys175) säilyi kolmen testatun etäviruksen joukossa, mukaan lukien jäännöskonformaatiot. Lisäksi kaikki virukset käyttivät aspartaattitähdettä vuorovaikutuksessa sinefungiinin aminoryhmän kanssa. Konservoituneet sitoutumismuodot kolmen viruksen välillä viittasivat siihen, että yhtä MTaasi-inhibiittoria voitaisiin mahdollisesti käyttää yleisviruksenvastaisena aineena. Nukleoemästen ja riboosirenkaan sitoutumistavoissa havaittiin kuitenkin eroja.

Kaiken kaikkiaan tutkimustulokset osoittivat, että MTaasi-pohjaiset estäjät voisivat olla yleiseurooppalaisia ​​kohteita.

Tämä uutisartikkeli oli katsaus alustavaan tieteelliseen raporttiin, jota ei ollut vertaisarvioitu julkaisuhetkellä. Alkuperäisen julkaisunsa jälkeen tieteellinen raportti on nyt vertaisarvioitu ja hyväksytty julkaistavaksi akateemisessa lehdessä. Linkit alustaviin ja vertaisarvioituihin raportteihin löytyvät tämän artikkelin lopun Lähteet-osiosta. Näytä lähteet

Viitteet:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Jan Silhan, Martin Klima, Dominika Chalupska, Jan Kozic, Evzen Boura. (2022). Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.27.509668 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.27.509668v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Silhan, Jan, Martin Klima, Tomas Otava, Petr Skvara, Dominika Chalupska, Karel Chalupsky, Jan Kozic, Radim Nencka und Evzen Boura. 2023. „Entdeckung und strukturelle Charakterisierung von Monkeypox-Virus-Methyltransferase-VP39-Inhibitoren zeigen Ähnlichkeiten mit SARS-CoV-2-Nsp14-Methyltransferase.“ Naturkommunikation 14 (1). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38019-1. https://www.nature.com/articles/s41467-023-38019-1.

Artikkelin tarkistukset

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.