Analyse structurale du virus de la variole du singe pour guider le développement d'agents antiviraux complets

Analyse structurale du virus de la variole du singe pour guider le développement d'agents antiviraux complets

Dans une étude récente publiée dans bioRxiv * Serveur de prépublication : les chercheurs ont examiné la structure cristalline du virus de la variole du singe (MPX) (MPXV) et le complexe de VP39, une 2′-O-ARN méthyltransférase (MTase), et de la sinefungine, un inhibiteur de la pan-MTase.

Studie: Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. Bildnachweis: Marina Demidiuk/Shutterstock

Cet article de presse était une revue d'un rapport scientifique préliminaire qui n'avait pas été évalué par des pairs au moment de la publication. Depuis sa publication initiale, le rapport scientifique a été évalué par des pairs et accepté pour publication dans une revue universitaire. Des liens vers les rapports préliminaires et évalués par des pairs se trouvent dans la section Sources à la fin de cet article. Afficher les sources

Le nombre de cas de MPX augmente chaque heure dans le monde et pourrait indiquer une nouvelle pandémie. L'analyse structurelle du MPXV pourrait être utile pour développer des agents antiviraux efficaces pour lutter contre le MPXV. Les poxvirus codent pour des enzymes de type décapage pour empêcher l’accumulation d’acide ribonucléique double brin (ARNdb) pendant l’infection, ce qui pourrait déclencher des réponses immunitaires antivirales innées. MPXV code pour l'enzyme variole, qui inhibe la voie cGAS-STING (stimulateur cyclique de la GMP-AMP synthase des gènes de l'interféron) déclenchée par l'acide ds-désoxyribonucléique (ADNdb).

La méthylation du nucléotide initial (nt) de la coiffe mature du MPXV (ou cap-1) en position 2′-O-ribose a été documentée. La MTase est requise par la famille de virus Poxviridiae (y compris MPXV) pour la synthèse du cap-0 et en ajoutant un autre groupe méthyle à la position 2′-O du ribose proximal, le capuchon immature (cap-0) peut être converti en capuchon mature. Cette étape est importante pour prévenir le développement de réponses immunitaires innées et est catalysée par VP39, la 2′-O MTase du MPXV.

À propos de l'étude

Dans la présente étude, les chercheurs ont examiné la structure complexe VP39-sinefungine du MPXV afin d’améliorer la compréhension des mécanismes d’inhibition de la molécule VP39 par la sinefungine. Ils ont également comparé la structure aux 2′-O-MTases des virus à ARN simple brin (ARNsb) tels que le virus Zika et le coronavirus 2 (SARS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère.

Le gène VP39 de la souche MPXV USA-May22 a été optimisé en codon pour l'expression dans E. coli en vue d'une synthèse et d'un clonage ultérieurs. Les cellules E. coli BL21 ont été transformées avec un plasmide exprimant VP39 et de l'IPTG (isopropyl-bD-thiogalactopyranoside) a été ajouté, suivi d'une purification du VP39 recombinant. Les cellules ont été centrifugées, lysées et le lysat a été soumis à une analyse chromatographique. VP39 a été concentré et mélangé avec de la sinefungine pour des expériences basées sur la cristallisation.

Les cristaux initialement formés ont été broyés et des tamis à graines et des substrats d'ARN ont été préparés par transcription in vitro. Par la suite, des tests de 2´-O-MTase et des analyses par échométrie de masse ont été effectués. Le taux d'activité MTase, l'inhibition de la 2′-O-MTase par la sinefungine et les taux de conversion du substrat (SAM) ont été déterminés, ainsi que les valeurs de concentration inhibitrice demi-maximale (IC50) ont été déterminées.

L'ensemble de données cristallographiques des cristaux de diffraction obtenus a été analysé. Les caractéristiques structurelles du complexe VP39/sinefungine ont été examinées en utilisant la méthode de substitution moléculaire avec la structure du complexe VP39/SAH du virus de la vaccine comme modèle de recherche. Pour examiner l'activité enzymatique du VP39 recombinant, deux substrats avec des avant-dernières bases différentes (ARN m7GpppA et ARN m7GpppG) ont été testés.

Les interactions VP39-sinefungine ont été analysées en construisant un modèle du complexe sinefungine:ARN:VP39 pour illustrer les mécanismes moléculaires sous-jacents à l'inhibition de VP39 par la sinefungine. De plus, les sites catalytiques de VP39 ont été comparés à ceux des MTases 2′-O-ribose provenant de virus Zika distants et du SRAS-CoV-2.

Résultats

La structure MPX comprenait un pli de Rossman similaire au pli alpha/bêta (α/β), avec la feuille β située au centre s'étendant sur β2-β10 selon un motif ressemblant à la lettre J. Notamment, le modèle a également été trouvé pour la protéine non structurale 2′-O MTase (nsp)1614 du SRAS-CoV-2. La feuille β centrale était attachée à une extrémité par les hélices alpha-1, alpha2, alpha-6 et alpha-7 et à l'autre extrémité par les hélices alpha-3 et alpha-7, et les côtés étaient reliés par β1. β11 et α5.

Les deux substrats RNAS se sont révélés acceptables ; cependant, celui avec une avant-dernière base de guanine était préférable. La sinefungine a inhibé VP39 avec une valeur IC50 de 41 µM. Il a été constaté que la sinefungine occupait la poche SAM avec son fragment de base adénine situé dans un canyon profond bordé de chaînes latérales hydrophobes liées à l'hydrogène des résidus Val116, Phe115, Leu159 et Val139. La sinefungine a protégé efficacement la région 2′-O-ribose avec ses groupes amino près de la région 2′-ribose où se trouverait autrement l'atome de soufre de SAM.

La gorge SAM avait deux extrémités, dont une extrémité, adjacente à la poche d’ARN, était cruciale pour positionner la SAM pour les réactions de méthyltransférase, et l’extrémité opposée, située à côté de la base adénine de la sinefungine, était inoccupée. Une inspection plus approfondie a révélé un réseau complexe de molécules d'eau sur le site, reliées par des liaisons hydrogène et liées aux résidus Glu118, Asn156 et Val116 ainsi qu'au fragment adénine.

Les molécules d'échafaudage de sinefungine avec des fragments susceptibles de déplacer les molécules d'eau et d'interagir directement avec les résidus Glu118, Asn156 et Val116 pourraient être des liants exceptionnellement bons, car le déplacement des molécules d'eau pourrait produire des effets entropiques favorables. La similitude du site de liaison MPXV SAM avec Zika et SARS-CoV-2 était frappante. Des conformations identiques ont été observées entre la sinefungine et les protéines NS5, nsp16 et VP39 de Zika, SARS-CoV-2 et MPXV, respectivement.

La tétrade du résidu catalytique (Asp138, Lys41, Glu218 et Lys175) pour MPXV a été conservée parmi les trois virus distants testés, y compris les conformations des résidus. De plus, tous les virus utilisaient un résidu aspartate pour interagir avec le groupe amino de la sinefungine. Les modes de liaison conservés entre les trois virus suggèrent qu’un seul inhibiteur de MTase pourrait potentiellement être utilisé comme agent pan-antiviral. Cependant, des différences dans les modes de liaison des bases nucléiques et du cycle ribose ont été observées.

Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont montré que les inhibiteurs basés sur la MTase pourraient être des cibles pan-antivirales.

Cet article de presse était une revue d'un rapport scientifique préliminaire qui n'avait pas été évalué par des pairs au moment de la publication. Depuis sa publication initiale, le rapport scientifique a été évalué par des pairs et accepté pour publication dans une revue universitaire. Des liens vers les rapports préliminaires et évalués par des pairs se trouvent dans la section Sources à la fin de cet article. Afficher les sources

Références :

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Jan Silhan, Martin Klima, Dominika Chalupska, Jan Kozic, Evzen Boura. (2022). Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.27.509668 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.27.509668v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Silhan, Jan, Martin Klima, Tomas Otava, Petr Skvara, Dominika Chalupska, Karel Chalupsky, Jan Kozic, Radim Nencka und Evzen Boura. 2023. „Entdeckung und strukturelle Charakterisierung von Monkeypox-Virus-Methyltransferase-VP39-Inhibitoren zeigen Ähnlichkeiten mit SARS-CoV-2-Nsp14-Methyltransferase.“ Naturkommunikation 14 (1). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38019-1. https://www.nature.com/articles/s41467-023-38019-1.

Révisions d'articles

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.