Strukturna analiza virusa majmunskih boginja za usmjeravanje razvoja sveobuhvatnih antivirusnih sredstava

Strukturna analiza virusa majmunskih boginja za usmjeravanje razvoja sveobuhvatnih antivirusnih sredstava

U nedavnoj studiji objavljenoj u bioRxiv * Preprint server: Istraživači su ispitivali kristalnu strukturu virusa majmunskih boginja (MPX) (MPXV) i kompleks VP39, 2'-O-RNA metiltransferaze (MTase), i sinefungina, inhibitora pan-MTase.

Studie: Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. Bildnachweis: Marina Demidiuk/Shutterstock

Ovaj novinski članak bio je pregled preliminarnog znanstvenog izvješća koje nije bilo recenzirano u vrijeme objavljivanja. Od svoje prve objave, znanstveno izvješće sada je recenzirano i prihvaćeno za objavljivanje u akademskom časopisu. Veze na preliminarna i recenzirana izvješća mogu se pronaći u odjeljku Izvori na kraju ovog članka. Pogledaj izvore

Broj slučajeva MPX-a raste svakog sata diljem svijeta i mogao bi ukazivati ​​na novu pandemiju. Strukturna analiza MPXV-a mogla bi biti od pomoći u razvoju učinkovitih antivirusnih sredstava za borbu protiv MPXV-a. Poksvirusi kodiraju enzime dekapirajućeg tipa kako bi spriječili nakupljanje dvolančane ribonukleinske kiseline (dsRNA) tijekom infekcije, što bi moglo pokrenuti urođene antivirusne imunološke odgovore. MPXV kodira pox enzim, koji inhibira cGAS-STING (ciklički GMP-AMP sintaza stimulator gena za interferon) put koji pokreće ds-dezoksiribonukleinska kiselina (dsDNA).

Dokumentirana je metilacija početnog nukleotida (nt) zrelog MPXV capa (ili cap-1) na položaju 2'-O-riboze. MTase je potrebna obitelji Poxviridiae virusa (uključujući MPXV) za sintezu cap-0, a dodavanjem druge metilne skupine na 2'-O položaj proksimalne riboze, nezreli cap (cap-0) može se pretvoriti u zreli cap. Korak je važan za sprječavanje razvoja urođenih imunoloških odgovora, a katalizira ga VP39, 2'-O MTase MPXV.

O studiju

U ovoj studiji istraživači su ispitivali strukturu kompleksa VP39-sinefungin MPXV-a kako bi poboljšali razumijevanje mehanizama inhibicije molekule VP39 sinefunginom. Također su usporedili strukturu s 2′-O-MTazama iz jednolančanih RNA virusa (ssRNA) kao što su Zika virus i teški akutni respiratorni sindrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2).

Gen VP39 soja MPXV USA-May22 je kodon optimiziran za ekspresiju u E. coli za naknadnu sintezu i kloniranje. Stanice E. coli BL21 su transformirane s plazmidom koji eksprimira VP39 i dodan je IPTG (izopropil-bD-tiogalaktopiranozid), nakon čega je uslijedilo pročišćavanje rekombinantnog VP39. Stanice su centrifugirane, lizirane, a lizat je podvrgnut kromatografskoj analizi. VP39 je koncentriran i pomiješan sa sinefunginom za pokuse temeljene na kristalizaciji.

Početno formirani kristali su zdrobljeni i in vitro transkripcijom su pripremljena klica sita i RNA supstrati. Nakon toga su provedeni testovi 2´-O-MTaze i eho masene spektrometrijske analize. Određena je brzina aktivnosti MTaze, inhibicija 2′-O-MTaze sinefunginom i stope konverzije supstrata (SAM), te su određene vrijednosti polumaksimalne inhibitorne koncentracije (IC50).

Analiziran je skup kristalografskih podataka dobivenih difrakcijskih kristala. Strukturne značajke kompleksa VP39/sinefungin ispitane su pomoću metode molekularne supstitucije sa strukturom kompleksa virusa vakcinije VP39/SAH kao modelom pretraživanja. Kako bi se ispitala enzimska aktivnost rekombinantnog VP39, testirana su dva supstrata s različitim pretposljednjim bazama (m7GpppA RNA i m7GpppG RNA).

Interakcije VP39-sinefungin analizirane su izgradnjom modela kompleksa sinefungin:RNA:VP39 kako bi se ilustrirali molekularni mehanizmi na kojima se temelji inhibicija VP39 sinefunginom. Osim toga, katalitička mjesta VP39 uspoređena su s mjestima 2′-O-riboze MTaze iz udaljenih Zika virusa i SARS-CoV-2.

Rezultati

Struktura MPX sadržavala je Rossmanov nabor sličan alfa/beta naboru (α/β), sa središnje smještenim β-listom koji se proteže na β2-β10 u uzorku koji podsjeća na slovo J. Značajno, uzorak je također pronađen za 2'-O MTase nestrukturni protein (nsp)1614 SARS-CoV-2. Središnji β-list bio je pričvršćen na jednom kraju alfa-1, alfa2, alfa-6 i alfa-7 spiralama, a na drugom kraju alfa-3 i alfa-7 spiralama, a strane su bile povezane pomoću β1. β11 i α5.

Utvrđeno je da su oba RNAS supstrata prihvatljiva; međutim, poželjniji je bio onaj s pretposljednjom gvaninskom bazom. Sinefungin je inhibirao VP39 s IC50 vrijednošću od 41 µM. Utvrđeno je da sinefungin zauzima SAM džep sa svojom baznom skupinom adenina smještenom u dubokom kanjonu obrubljenom vodikovim vezama hidrofobnih bočnih lanaca Val116, Phe115, Leu159 i Val139 ostataka. Sinefungin je učinkovito zaštitio regiju 2'-O-riboze sa svojim amino skupinama blizu regije 2'-riboze gdje bi se inače nalazio atom sumpora SAM-a.

Žljeb SAM-a imao je dva kraja, od kojih je jedan kraj, uz RNA džep, bio ključan za pozicioniranje SAM-a za reakcije metiltransferaze, a suprotni kraj, smješten uz adenin bazu sinefungina, bio je nezauzet. Pomnije ispitivanje otkrilo je složenu mrežu molekula vode na tom mjestu, povezanih vodikovim vezama i vezanih za ostatke Glu118, Asn156 i Val116, kao i za adeninski dio.

Molekule skele sinefungina s dijelovima koji bi mogli istisnuti molekule vode i izravno komunicirati s ostacima Glu118, Asn156 i Val116 mogli bi biti iznimno dobra veziva jer bi istiskivanje molekula vode moglo proizvesti povoljne entropijske učinke. Sličnost mjesta vezivanja MPXV SAM sa Zikom i SARS-CoV-2 bila je zapanjujuća. Identične konformacije uočene su između sinefungina i proteina NS5, nsp16 i VP39 virusa Zika, SARS-CoV-2 i MPXV.

Tetrad katalitičkog ostatka (Asp138, Lys41, Glu218 i Lys175) za MPXV sačuvan je među tri testirana udaljena virusa, uključujući konformacije ostataka. Osim toga, svi su virusi koristili ostatak aspartata za interakciju s amino skupinom sinefungina. Konzervirani načini vezanja između tri virusa sugeriraju da bi se jedan inhibitor MTase potencijalno mogao koristiti kao pan-antivirusno sredstvo. Međutim, uočene su razlike u načinima vezanja nukleobaza i riboznog prstena.

Sve u svemu, rezultati studije su pokazali da bi inhibitori na bazi MTase mogli biti pan-antivirusni ciljevi.

Ovaj novinski članak bio je pregled preliminarnog znanstvenog izvješća koje nije bilo recenzirano u vrijeme objavljivanja. Od svoje prve objave, znanstveno izvješće sada je recenzirano i prihvaćeno za objavljivanje u akademskom časopisu. Veze na preliminarna i recenzirana izvješća mogu se pronaći u odjeljku Izvori na kraju ovog članka. Pogledaj izvore

Reference:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Jan Silhan, Martin Klima, Dominika Chalupska, Jan Kozic, Evzen Boura. (2022). Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.27.509668 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.27.509668v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Silhan, Jan, Martin Klima, Tomas Otava, Petr Skvara, Dominika Chalupska, Karel Chalupsky, Jan Kozic, Radim Nencka und Evzen Boura. 2023. „Entdeckung und strukturelle Charakterisierung von Monkeypox-Virus-Methyltransferase-VP39-Inhibitoren zeigen Ähnlichkeiten mit SARS-CoV-2-Nsp14-Methyltransferase.“ Naturkommunikation 14 (1). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38019-1. https://www.nature.com/articles/s41467-023-38019-1.

Revizije članaka

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.