A majomhimlő vírus szerkezeti elemzése átfogó vírusellenes szerek kifejlesztésének irányítására

A majomhimlő vírus szerkezeti elemzése átfogó vírusellenes szerek kifejlesztésének irányítására

Egy nemrégiben megjelent tanulmányban bioRxiv * Preprint szerver: A kutatók megvizsgálták a majomhimlő vírus (MPX) (MPXV) kristályos szerkezetét, valamint a VP39, egy 2'-O-RNS metiltranszferáz (MTase) és a sinefungin, egy pán-MTáz inhibitor komplexét.

Studie: Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. Bildnachweis: Marina Demidiuk/Shutterstock

Ez a hírcikk egy előzetes tudományos jelentés áttekintése volt, amelyet a közzététel időpontjában még nem értékeltek. Az első megjelenés óta a tudományos jelentést szakértői lektoráltak, és elfogadták egy tudományos folyóiratban való közzétételre. Az előzetes és a lektorált jelentésekre mutató hivatkozások a cikk végén található Források részben találhatók. Források megtekintése

Az MPX-esetek száma óránként növekszik világszerte, és új járványra utalhat. Az MPXV szerkezeti elemzése hasznos lehet hatékony vírusellenes szerek kifejlesztésében az MPXV leküzdésére. A himlővírusok decapping típusú enzimeket kódolnak, hogy megakadályozzák a fertőzés során a kettős szálú ribonukleinsav (dsRNS) felhalmozódását, ami veleszületett vírusellenes immunválaszokat válthat ki. Az MPXV a pox enzimet kódolja, amely gátolja a ds-dezoxiribonukleinsav (dsDNS) által kiváltott cGAS-STING (interferon gének ciklikus GMP-AMP szintáz stimulátora) útvonalát.

Dokumentálták az érett MPXV cap (vagy cap-1) kezdeti nukleotidjának (nt) metilezését a 2′-O-ribóz pozícióban. A Poxviridiae víruscsaládnak (beleértve az MPXV-t is) MTázra van szüksége a cap-0 szintéziséhez, és egy másik metilcsoport hozzáadásával a proximális ribóz 2′-O pozíciójában az éretlen sapka (cap-0) az érett sapkává alakítható. A lépés fontos a veleszületett immunválaszok kialakulásának megelőzésében, és a VP39, az MPXV 2′-O MTáza katalizálja.

A tanulmányról

Jelen tanulmányban a kutatók megvizsgálták az MPXV VP39-szinefungin komplex szerkezetét, hogy jobban megértsék a VP39 molekula szinefungin általi gátlásának mechanizmusait. Összehasonlították a szerkezetet az egyszálú RNS-vírusok (ssRNS), például a Zika-vírus és a súlyos akut légúti szindróma koronavírus 2 (SARS-CoV-2) 2'-O-MTázaival is.

Az MPXV USA-May22 törzs VP39 génjét kodonnal optimalizáltuk E. coliban való expresszióra a későbbi szintézis és klónozás céljából. E. coli BL21 sejteket transzformáltunk VP39-et expresszáló plazmiddal, és IPTG-t (izopropil-bD-tiogalaktopiranozid) adtunk hozzá, majd a rekombináns VP39-et megtisztítottuk. A sejteket centrifugáltuk, lizáltuk, és a lizátumot kromatográfiás elemzésnek vetettük alá. A VP39-et betöményítettük és szinefunginnal kevertük a kristályosításon alapuló kísérletekhez.

A kezdetben képződött kristályokat összetörtük, és in vitro transzkripcióval oltószitákat és RNS-szubsztrátokat állítottunk elő. Ezt követően 2'-O-MTase vizsgálatokat és echo tömegspektrometriás elemzéseket végeztünk. Meghatároztuk az MTase aktivitás mértékét, a 2'-O-MTáz gátlást a szinefungin által és a szubsztrát konverziós rátákat (SAM), valamint meghatároztuk a maximális gátló koncentráció fele (IC50) értékeket.

A kapott diffrakciós kristályok krisztallográfiai adatsorát elemeztem. A VP39/sinefungin komplex szerkezeti jellemzőit molekuláris szubsztitúciós módszerrel vizsgáltuk keresési modellként a vaccinia vírus VP39/SAH komplex szerkezetével. A rekombináns VP39 enzimaktivitásának vizsgálatára két, utolsó előtti bázisú szubsztrátot (m7GpppA RNS és m7GpppG RNS) teszteltünk.

A VP39-szinefungin kölcsönhatásokat a sinefungin:RNS:VP39 komplex modelljének felépítésével elemeztük, hogy szemléltesse a VP39 sinefungin általi gátlása mögött meghúzódó molekuláris mechanizmusokat. Ezenkívül a VP39 katalitikus helyeit összehasonlították a távoli Zika-vírusokból és a SARS-CoV-2-ből származó 2'-O-ribóz MTázok katalitikus helyeivel.

Eredmények

Az MPX szerkezet egy Rossman-hajtást tartalmazott, amely hasonló az alfa/béta hajtáshoz (α/β), a központilag elhelyezkedő β-lap pedig a β2-β10-et ívelte át a J betűhöz hasonló mintázatban. Nevezetesen, a mintát megtalálták a SARS-CoV-2 2'-O MTáz nem szerkezeti fehérjéjére (nsp)1614 is. A központi β-lapot az egyik végén alfa-1, alfa2, alfa-6 és alfa-7 hélixek, a másik végén pedig az alfa-3 és alfa-7 hélixek erősítették, az oldalakat pedig β1 kötötte össze. β11 és α5.

Mindkét RNAS szubsztrátot elfogadhatónak találtuk; az utolsó előtti guaninbázisú azonban előnyösebb volt. A sinefungin 41 µM IC50 értékkel gátolta a VP39-et. Úgy találták, hogy a sinefungin a SAM zsebet foglalja el, adenin bázisrészével egy mély kanyonban, amelyet a Val116, Phe115, Leu159 és Val139 aminosavak hidrogénkötésű hidrofób oldalláncai szegélyeznek. A sinefungin hatékonyan védte a 2′-O-ribóz régiót aminocsoportjaival a 2′-ribóz régió közelében, ahol egyébként a SAM kénatomja található.

A SAM-szorosnak két vége volt, amelyek közül az egyik, az RNS-zsebbel szomszédos vége kulcsfontosságú volt a SAM pozicionálásához a metiltranszferáz-reakciókhoz, a másik vége pedig, amely a szinefungin adeninbázisa mellett található, nem foglalt. Közelebbről megvizsgálva vízmolekulák komplex hálózatát tárták fel a helyszínen, amelyek hidrogénkötésekkel kapcsolódnak össze, és a Glu118, Asn156 és Val116 maradékokhoz, valamint az adenin részhez kötődnek.

A vízmolekulákat kiszorító és a Glu118, Asn156 és Val116 maradékokkal közvetlenül kölcsönhatásba lépő sinefungin vázmolekulák kivételesen jó kötőanyagok lehetnek, mivel a vízmolekulák kiszorítása kedvező entrópiás hatásokat válthat ki. Az MPXV SAM kötőhelyének a Zika-hoz és a SARS-CoV-2-höz való hasonlósága feltűnő volt. Azonos konformációkat figyeltek meg a sinefungin és a Zika NS5, nsp16 és VP39 fehérjéi között, a SARS-CoV-2 és MPXV között.

Az MPXV katalitikus maradék tetradja (Asp138, Lys41, Glu218 és Lys175) konzervált volt a három vizsgált távoli vírus között, beleértve a maradék konformációkat is. Ezenkívül minden vírus aszpartát-maradékot használt a szinefungin aminocsoportjával való kölcsönhatáshoz. A három vírus közötti konzervált kötődési módok arra utalnak, hogy egyetlen MTáz-inhibitor potenciálisan alkalmazható pán-vírusellenes szerként. A nukleobázisok és a ribózgyűrű kötődési módjaiban azonban eltéréseket figyeltek meg.

Összességében a vizsgálati eredmények azt mutatták, hogy az MTáz-alapú inhibitorok pán-vírusellenes célpontok lehetnek.

Ez a hírcikk egy előzetes tudományos jelentés áttekintése volt, amelyet a közzététel időpontjában még nem értékeltek. Az első megjelenés óta a tudományos jelentést szakértői lektoráltak, és elfogadták egy tudományos folyóiratban való közzétételre. Az előzetes és a lektorált jelentésekre mutató hivatkozások a cikk végén található Források részben találhatók. Források megtekintése

Referenciák:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Jan Silhan, Martin Klima, Dominika Chalupska, Jan Kozic, Evzen Boura. (2022). Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.27.509668 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.27.509668v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Silhan, Jan, Martin Klima, Tomas Otava, Petr Skvara, Dominika Chalupska, Karel Chalupsky, Jan Kozic, Radim Nencka und Evzen Boura. 2023. „Entdeckung und strukturelle Charakterisierung von Monkeypox-Virus-Methyltransferase-VP39-Inhibitoren zeigen Ähnlichkeiten mit SARS-CoV-2-Nsp14-Methyltransferase.“ Naturkommunikation 14 (1). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38019-1. https://www.nature.com/articles/s41467-023-38019-1.

Cikk revíziók

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.