Analisi strutturale del virus del vaiolo delle scimmie per guidare lo sviluppo di agenti antivirali completi

Analisi strutturale del virus del vaiolo delle scimmie per guidare lo sviluppo di agenti antivirali completi

In un recente studio pubblicato su bioRxiv * Server di prestampa: i ricercatori hanno esaminato la struttura cristallina del virus del vaiolo delle scimmie (MPX) (MPXV) e il complesso di VP39, una 2′-O-RNA metiltransferasi (MTasi) e sinefungina, un inibitore della pan-MTasi.

Studie: Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. Bildnachweis: Marina Demidiuk/Shutterstock

Questo articolo di notizie era una revisione di un rapporto scientifico preliminare che non era stato sottoposto a revisione paritaria al momento della pubblicazione. Dalla sua pubblicazione iniziale, il rapporto scientifico è stato ora sottoposto a revisione paritaria e accettato per la pubblicazione in una rivista accademica. I collegamenti ai rapporti preliminari e sottoposti a revisione paritaria possono essere trovati nella sezione Fonti alla fine di questo articolo. Visualizza fonti

Il numero di casi di MPX aumenta ogni ora in tutto il mondo e potrebbe indicare una nuova pandemia. L'analisi strutturale dell'MPXV potrebbe essere utile per sviluppare agenti antivirali efficaci per combattere l'MPXV. I poxvirus codificano enzimi di tipo decapping per prevenire l’accumulo di acido ribonucleico a doppio filamento (dsRNA) durante l’infezione, che potrebbe innescare risposte immunitarie antivirali innate. MPXV codifica per l'enzima vaiolo, che inibisce la via cGAS-STING (stimolatore ciclico GMP-AMP sintasi dei geni dell'interferone) attivata dall'acido ds-desossiribonucleico (dsDNA).

È stata documentata la metilazione del nucleotide iniziale (nt) del cap MPXV maturo (o cap-1) nella posizione 2′-O-ribosio. La MTasi è richiesta dalla famiglia di virus Poxviridiae (incluso MPXV) per la sintesi del cap-0 e aggiungendo un altro gruppo metilico nella posizione 2′-O del ribosio prossimale, il cappuccio immaturo (cap-0) può essere convertito nel cappuccio maturo. Il passaggio è importante per prevenire lo sviluppo di risposte immunitarie innate ed è catalizzato da VP39, la 2′-O MTasi di MPXV.

A proposito dello studio

Nel presente studio, i ricercatori hanno esaminato la struttura del complesso VP39-sinefungina di MPXV per migliorare la comprensione dei meccanismi di inibizione della molecola VP39 da parte della sinefungina. Hanno anche confrontato la struttura con le 2′-O-MTasi dei virus RNA a filamento singolo (ssRNA) come il virus Zika e la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2).

Il gene VP39 del ceppo MPXV USA-May22 è stato ottimizzato per l'espressione in E. coli per la successiva sintesi e clonazione. Le cellule BL21 di E. coli sono state trasformate con un plasmide che esprime VP39 ed è stato aggiunto IPTG (isopropil-bD-tiogalattopiranoside), seguito dalla purificazione del VP39 ricombinante. Le cellule sono state centrifugate, lisate e il lisato è stato sottoposto ad analisi cromatografica. VP39 è stato concentrato e miscelato con sinefungina per esperimenti basati sulla cristallizzazione.

I cristalli inizialmente formati sono stati frantumati e setacci di semi e substrati di RNA sono stati preparati mediante trascrizione in vitro. Successivamente, sono stati eseguiti test della 2'-O-MTasi e analisi di spettrometria di massa eco. Sono stati determinati il ​​tasso di attività della MTasi, l'inibizione della 2′-O-MTasi da parte della sinefungina e i tassi di conversione del substrato (SAM) e sono stati determinati i valori della concentrazione inibitoria semimassima (IC50).

È stato analizzato il set di dati cristallografici dei cristalli di diffrazione ottenuti. Le caratteristiche strutturali del complesso VP39/sinefungina sono state esaminate utilizzando il metodo di sostituzione molecolare con la struttura del complesso VP39/SAH del virus vaccinico come modello di ricerca. Per esaminare l'attività enzimatica del VP39 ricombinante, sono stati testati due substrati con penultime basi diverse (m7GpppA RNA e m7GpppG RNA).

Le interazioni VP39-sinefungina sono state analizzate costruendo un modello del complesso sinefungina:RNA:VP39 per illustrare i meccanismi molecolari alla base dell'inibizione di VP39 da parte della sinefungina. Inoltre, i siti catalitici di VP39 sono stati confrontati con quelli delle 2′-O-ribosio MTasi dei virus Zika distanti e del SARS-CoV-2.

Risultati

La struttura MPX comprendeva una piega di Rossman simile alla piega alfa/beta (α/β), con il foglio β posizionato centralmente che si estendeva su β2-β10 in uno schema simile alla lettera J. In particolare, il modello è stato trovato anche per la proteina non strutturale 2′-O MTase (nsp) 1614 di SARS-CoV-2. Il foglio β centrale era attaccato a un'estremità dalle eliche alfa-1, alfa2, alfa-6 e alfa-7 e all'altra estremità dalle eliche alfa-3 e alfa-7, e i lati erano collegati da β1. β11 e α5.

Entrambi i substrati RNAS sono risultati accettabili; era comunque preferibile quello con penultima base di guanina. Sinefungin ha inibito VP39 con un valore IC50 di 41 µM. Si è scoperto che Sinefungin occupa la tasca SAM con la sua porzione di base adenina situata in un canyon profondo fiancheggiato da catene laterali idrofobiche legate con idrogeno dei residui Val116, Phe115, Leu159 e Val139. Sinefungin ha protetto efficacemente la regione 2′-O-ribosio con i suoi gruppi amminici vicino alla regione 2′-ribosio dove altrimenti si troverebbe l'atomo di zolfo di SAM.

La gola del SAM aveva due estremità, di cui un'estremità, adiacente alla tasca dell'RNA, era cruciale per il posizionamento del SAM per le reazioni della metiltransferasi, e l'estremità opposta, situata vicino alla base di adenina della sinefungina, non era occupata. Un esame più attento ha rivelato una complessa rete di molecole d’acqua nel sito, collegate da legami idrogeno e legate ai residui Glu118, Asn156 e Val116, nonché alla porzione adenina.

Le molecole dell'impalcatura sinefungina con porzioni che potrebbero spostare le molecole d'acqua e interagire direttamente con i residui Glu118, Asn156 e Val116 potrebbero essere leganti eccezionalmente buoni perché lo spostamento delle molecole d'acqua potrebbe produrre effetti entropici favorevoli. La somiglianza del sito di legame SAM dell’MPXV con Zika e SARS-CoV-2 era sorprendente. Sono state osservate conformazioni identiche tra sinefungina e le proteine ​​NS5, nsp16 e VP39 di Zika, SARS-CoV-2 e MPXV, rispettivamente.

Il tetrade residuo catalitico (Asp138, Lys41, Glu218 e Lys175) per MPXV è stato conservato tra i tre virus remoti testati, comprese le conformazioni dei residui. Inoltre, tutti i virus utilizzavano un residuo di aspartato per interagire con il gruppo amminico della sinefungina. Le modalità di legame conservate tra i tre virus hanno suggerito che un singolo inibitore della MTasi potrebbe essere potenzialmente utilizzato come agente pan-antivirale. Tuttavia, sono state osservate differenze nelle modalità di legame delle basi azotate e dell'anello di ribosio.

Nel complesso, i risultati dello studio hanno mostrato che gli inibitori basati sulla MTasi potrebbero essere bersagli pan-antivirali.

Questo articolo di notizie era una revisione di un rapporto scientifico preliminare che non era stato sottoposto a revisione paritaria al momento della pubblicazione. Dalla sua pubblicazione iniziale, il rapporto scientifico è stato ora sottoposto a revisione paritaria e accettato per la pubblicazione in una rivista accademica. I collegamenti ai rapporti preliminari e sottoposti a revisione paritaria possono essere trovati nella sezione Fonti alla fine di questo articolo. Visualizza fonti

Riferimenti:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Jan Silhan, Martin Klima, Dominika Chalupska, Jan Kozic, Evzen Boura. (2022). Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.27.509668 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.27.509668v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Silhan, Jan, Martin Klima, Tomas Otava, Petr Skvara, Dominika Chalupska, Karel Chalupsky, Jan Kozic, Radim Nencka und Evzen Boura. 2023. „Entdeckung und strukturelle Charakterisierung von Monkeypox-Virus-Methyltransferase-VP39-Inhibitoren zeigen Ähnlichkeiten mit SARS-CoV-2-Nsp14-Methyltransferase.“ Naturkommunikation 14 (1). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38019-1. https://www.nature.com/articles/s41467-023-38019-1.

Revisioni degli articoli

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.