Pērtiķu baku vīrusa strukturālā analīze, lai vadītu visaptverošu pretvīrusu līdzekļu izstrādi

Pērtiķu baku vīrusa strukturālā analīze, lai vadītu visaptverošu pretvīrusu līdzekļu izstrādi

Nesenā pētījumā, kas publicēts bioRxiv * Priekšdrukas serveris: pētnieki pārbaudīja pērtiķu baku vīrusa (MPX) (MPXV) kristālisko struktūru un VP39, 2′-O-RNS metiltransferāzes (MTase) un sinefungīna, pan-MTase inhibitora, kompleksu.

Studie: Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. Bildnachweis: Marina Demidiuk/Shutterstock

Šis ziņu raksts bija pārskats par sākotnējo zinātnisko ziņojumu, kas publicēšanas laikā nebija recenzēts. Kopš sākotnējās publicēšanas zinātniskais ziņojums tagad ir recenzēts un pieņemts publicēšanai akadēmiskajā žurnālā. Saites uz provizoriskajiem un salīdzinošajiem pārskatiem ir atrodamas sadaļā Avoti šī raksta beigās. Skatīt avotus

MPX gadījumu skaits pasaulē pieaug katru stundu, un tas varētu liecināt par jaunu pandēmiju. MPXV strukturālā analīze varētu būt noderīga, izstrādājot efektīvus pretvīrusu līdzekļus MPXV apkarošanai. Baku vīrusi kodē atdaloša tipa enzīmus, lai novērstu divpavedienu ribonukleīnskābes (dsRNS) uzkrāšanos infekcijas laikā, kas varētu izraisīt iedzimtas pretvīrusu imūnās atbildes. MPXV kodē baku enzīmu, kas inhibē cGAS-STING (interferona gēnu cikliskais GMP-AMP sintāzes stimulators) ceļu, ko iedarbina ds-dezoksiribonukleīnskābe (dsDNS).

Tika dokumentēta nobriedušā MPXV vāciņa (vai cap-1) sākotnējā nukleotīda (nt) metilēšana 2′-O-ribozes pozīcijā. MTase ir nepieciešama Poxviridiae vīrusu saimei (ieskaitot MPXV) cap-0 sintēzei, un, pievienojot citu metilgrupu proksimālās ribozes 2′-O pozīcijā, nenobriedušo vāciņu (cap-0) var pārveidot par nobriedušu vāciņu. Šis solis ir svarīgs, lai novērstu iedzimtu imūnreakciju attīstību, un to katalizē VP39, MPXV 2′-O MTāze.

Par pētījumu

Šajā pētījumā pētnieki pārbaudīja MPXV VP39-sinefungīna komplekso struktūru, lai uzlabotu izpratni par VP39 molekulas inhibīcijas mehānismiem ar sinefungīnu. Viņi arī salīdzināja struktūru ar 2′-O-MTāzēm no vienpavedienu RNS vīrusiem (ssRNS), piemēram, Zika vīrusa un smaga akūta respiratorā sindroma koronavīrusa 2 (SARS-CoV-2).

MPXV USA-May22 celma VP39 gēns tika optimizēts ekspresijai E. coli turpmākai sintēzei un klonēšanai. E. coli BL21 šūnas tika transformētas ar VP39 ekspresējošu plazmīdu un pievienots IPTG (izopropil-bD-tiogalaktopiranozīds), kam sekoja rekombinantā VP39 attīrīšana. Šūnas tika centrifugētas, lizētas un lizāts tika pakļauts hromatogrāfiskai analīzei. VP39 tika koncentrēts un sajaukts ar sinefungīnu eksperimentiem, kuru pamatā ir kristalizācija.

Sākotnēji izveidotie kristāli tika sasmalcināti un ar in vitro transkripciju sagatavoti sēklu sieti un RNS substrāti. Pēc tam tika veikti 2'-O-MTase testi un atbalss masas spektrometrijas analīzes. Tika noteikts MTāzes aktivitātes ātrums, 2′-O-MTāzes inhibīcija ar sinefungīnu un substrāta konversijas ātrumi (SAM), kā arī tika noteiktas pusi no maksimālās inhibējošās koncentrācijas (IC50).

Tika analizēta iegūto difrakcijas kristālu kristalogrāfiskā datu kopa. VP39/sinefungīna kompleksa strukturālās iezīmes tika pārbaudītas, izmantojot molekulārās aizvietošanas metodi ar vaccinia vīrusa VP39/SAH kompleksa struktūru kā meklēšanas modeli. Lai pārbaudītu rekombinantā VP39 fermentatīvo aktivitāti, tika pārbaudīti divi substrāti ar dažādām priekšpēdējām bāzēm (m7GpppA RNS un m7GpppG RNS).

VP39-sinefungīna mijiedarbība tika analizēta, veidojot sinefungīna: RNS: VP39 kompleksa modeli, lai ilustrētu molekulāros mehānismus, kas ir pamatā VP39 inhibīcijai ar sinefungīnu. Turklāt VP39 katalītiskās vietas tika salīdzinātas ar 2′-O-ribozes MTāzes no attāliem Zika vīrusiem un SARS-CoV-2.

Rezultāti

MPX struktūra ietvēra Rossman kroku, kas bija līdzīga alfa/beta krokam (α / β), ar centrālo β-loksni, kas aptver β2-β10 formā, kas atgādina J burtu. Konkrēti, modelis tika atrasts arī SARS-CoV-2 2′-O MTase nestrukturālajam proteīnam (nsp)1614. Centrālā β-loksne vienā galā tika piestiprināta ar alfa-1, alfa2, alfa-6 un alfa-7 spirālēm, bet otrā galā ar alfa-3 un alfa-7 spirālēm, un malas bija savienotas ar β1. β11 un α5.

Abi RNAS substrāti tika atzīti par pieņemamiem; tomēr priekšroka bija tāda, kurai ir priekšpēdējā guanīna bāze. Sinefungīns inhibēja VP39 ar IC50 vērtību 41 µM. Tika konstatēts, ka sinefungīns aizņem SAM kabatu ar adenīna bāzes daļu, kas atrodas dziļā kanjonā, ko izklāta ar ūdeņraža saiti hidrofobām Val116, Phe115, Leu159 un Val139 atlieku sānu ķēdēm. Sinefungīns efektīvi aizsargāja 2′-O-ribozes reģionu ar tā aminogrupām netālu no 2′-ribozes reģiona, kur pretējā gadījumā atrastos SAM sēra atoms.

SAM aizai bija divi gali, no kuriem viens gals, kas atrodas blakus RNS kabatai, bija izšķirošs, lai novietotu SAM metiltransferāzes reakcijām, un pretējais gals, kas atrodas blakus sinefungīna adenīna bāzei, nebija aizņemts. Ciešāka pārbaude atklāja kompleksu ūdens molekulu tīklu vietā, kas savienota ar ūdeņraža saitēm un saistīta ar atlikumiem Glu118, Asn156 un Val116, kā arī adenīna daļu.

Sinefungīna sastatņu molekulas ar daļām, kas varētu izspiest ūdens molekulas un tieši mijiedarboties ar Glu118, Asn156 un Val116 atlikumiem, varētu būt īpaši labas saistvielas, jo ūdens molekulu pārvietošana var radīt labvēlīgus entropiskus efektus. MPXV SAM saistīšanās vietas līdzība ar Zika un SARS-CoV-2 bija pārsteidzoša. Tika novērotas identiskas konformācijas starp sinefungīnu un attiecīgi Zika, SARS-CoV-2 un MPXV NS5, nsp16 un VP39 proteīniem.

MPXV katalītiskā atlikuma tetrāde (Asp138, Lys41, Glu218 un Lys175) tika saglabāta starp trim pārbaudītajiem attālajiem vīrusiem, ieskaitot atlieku konformācijas. Turklāt visi vīrusi izmantoja aspartāta atlikumu, lai mijiedarbotos ar sinefungīna aminogrupu. Konservētie saistīšanās režīmi starp trim vīrusiem liecināja, ka vienu MTase inhibitoru varētu izmantot kā pretvīrusu līdzekli. Tomēr tika novērotas atšķirības nukleobāžu un ribozes gredzena saistīšanās režīmos.

Kopumā pētījuma rezultāti parādīja, ka inhibitori, kuru pamatā ir MTase, varētu būt pretvīrusu mērķi.

Šis ziņu raksts bija pārskats par sākotnējo zinātnisko ziņojumu, kas publicēšanas laikā nebija recenzēts. Kopš sākotnējās publicēšanas zinātniskais ziņojums tagad ir recenzēts un pieņemts publicēšanai akadēmiskajā žurnālā. Saites uz provizoriskajiem un salīdzinošajiem pārskatiem ir atrodamas sadaļā Avoti šī raksta beigās. Skatīt avotus

Atsauces:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Jan Silhan, Martin Klima, Dominika Chalupska, Jan Kozic, Evzen Boura. (2022). Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.27.509668 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.27.509668v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Silhan, Jan, Martin Klima, Tomas Otava, Petr Skvara, Dominika Chalupska, Karel Chalupsky, Jan Kozic, Radim Nencka und Evzen Boura. 2023. „Entdeckung und strukturelle Charakterisierung von Monkeypox-Virus-Methyltransferase-VP39-Inhibitoren zeigen Ähnlichkeiten mit SARS-CoV-2-Nsp14-Methyltransferase.“ Naturkommunikation 14 (1). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38019-1. https://www.nature.com/articles/s41467-023-38019-1.

Rakstu labojumi

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.