Structurele analyse van het apenpokkenvirus om de ontwikkeling van uitgebreide antivirale middelen te begeleiden

Structurele analyse van het apenpokkenvirus om de ontwikkeling van uitgebreide antivirale middelen te begeleiden

Uit een recente studie gepubliceerd in bioRxiv * Preprint-server: onderzoekers onderzochten de kristallijne structuur van het apenpokkenvirus (MPX) (MPXV) en het complex van VP39, een 2′-O-RNA-methyltransferase (MTase) en sinefungine, een pan-MTase-remmer.

Studie: Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. Bildnachweis: Marina Demidiuk/Shutterstock

Dit nieuwsartikel was een recensie van een voorlopig wetenschappelijk rapport dat op het moment van publicatie nog niet door vakgenoten was beoordeeld. Sinds de eerste publicatie is het wetenschappelijk rapport nu peer-reviewed en geaccepteerd voor publicatie in een academisch tijdschrift. Links naar de voorlopige en peer-reviewed rapporten zijn te vinden in de sectie Bronnen aan het einde van dit artikel. Bekijk bronnen

Het aantal MPX-gevallen neemt wereldwijd elk uur toe en zou kunnen wijzen op een nieuwe pandemie. Structurele analyse van MPXV zou nuttig kunnen zijn bij het ontwikkelen van effectieve antivirale middelen om MPXV te bestrijden. Pokkenvirussen coderen voor enzymen van het decapping-type om de accumulatie van dubbelstrengs ribonucleïnezuur (dsRNA) tijdens infectie te voorkomen, wat aangeboren antivirale immuunreacties zou kunnen veroorzaken. MPXV codeert voor het pokken-enzym, dat de cGAS-STING-route (cyclische GMP-AMP-synthasestimulator van interferongenen) remt die wordt geactiveerd door ds-deoxyribonucleïnezuur (dsDNA).

Methylering van het initiële nucleotide (nt) van de volwassen MPXV-dop (of cap-1) op de 2'-O-ribose-positie werd gedocumenteerd. MTase is vereist door de Poxviridiae-familie van virussen (inclusief MPXV) voor cap-0-synthese en door een andere methylgroep toe te voegen op de 2′-O-positie van de proximale ribose, kan de onrijpe dop (cap-0) worden omgezet in de volwassen dop. De stap is belangrijk voor het voorkomen van de ontwikkeling van aangeboren immuunreacties en wordt gekatalyseerd door VP39, de 2′-O MTase van MPXV.

Over de studie

In de huidige studie onderzochten onderzoekers de VP39-sinefungin-complexstructuur van MPXV om het begrip van de mechanismen van remming van het VP39-molecuul door sinefungine te verbeteren. Ze vergeleken de structuur ook met 2′-O-MTases van enkelstrengige RNA-virussen (ssRNA) zoals het Zika-virus en het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2).

Het VP39-gen van de MPXV USA-May22-stam was codon geoptimaliseerd voor expressie in E. coli voor daaropvolgende synthese en klonering. E. coli BL21-cellen werden getransformeerd met plasmide dat VP39 tot expressie brengt en IPTG (isopropyl-bD-thiogalactopyranoside) werd toegevoegd, gevolgd door zuivering van het recombinante VP39. De cellen werden gecentrifugeerd, gelyseerd en het lysaat werd onderworpen aan chromatografische analyse. VP39 werd geconcentreerd en gemengd met sinefungine voor op kristallisatie gebaseerde experimenten.

De aanvankelijk gevormde kristallen werden vermalen en zaadzeven en RNA-substraten werden bereid door in vitro transcriptie. Vervolgens werden 2´-O-MTase-testen en echo-massaspectrometrieanalyses uitgevoerd. De snelheid van MTase-activiteit, 2′-O-MTase-remming door sinefungine en substraatconversiesnelheden (SAM) werden bepaald, en de waarden van de halfmaximale remmende concentratie (IC50) werden bepaald.

De kristallografische gegevensset van de verkregen diffractiekristallen werd geanalyseerd. De structurele kenmerken van het VP39/sinefunginecomplex werden onderzocht met behulp van de moleculaire substitutiemethode met de VP39/SAH-complexstructuur van het vacciniavirus als zoekmodel. Om de enzymatische activiteit van recombinant VP39 te onderzoeken, werden twee substraten met verschillende voorlaatste basen (m7GpppA-RNA en m7GpppG-RNA) getest.

De VP39-sinefungin-interacties werden geanalyseerd door een model van het sinefungine:RNA:VP39-complex te bouwen om de moleculaire mechanismen te illustreren die ten grondslag liggen aan de VP39-remming door sinefungine. Bovendien werden de katalytische plaatsen van VP39 vergeleken met die van 2′-O-ribose MTases van verre Zika-virussen en SARS-CoV-2.

Resultaten

De MPX-structuur omvatte een Rossman-vouw vergelijkbaar met de alfa/bèta-vouw (α/β), waarbij het centraal gelegen β-blad β2-β10 omspande in een patroon dat lijkt op de J-letter. Met name werd het patroon ook gevonden voor het niet-structurele 2′-O MTase-eiwit (nsp)1614 van SARS-CoV-2. De centrale β-sheet was aan het ene uiteinde bevestigd door alfa-1, alpha2, alpha-6 en alpha-7-helices en aan het andere uiteinde door de alpha-3- en alpha-7-helices, en de zijkanten waren verbonden door β1. β11 en α5.

Beide RNAS-substraten bleken acceptabel te zijn; degene met een voorlaatste guaninebase had echter de voorkeur. Sinefungin remde VP39 met een IC50-waarde van 41 µM. Er werd gevonden dat sinefungine de SAM-pocket bezet met zijn adeninebasisgroep gelegen in een diepe kloof omzoomd door waterstofgebonden hydrofobe zijketens van de Val116-, Phe115-, Leu159- en Val139-residuen. Sinefungine beschermde op efficiënte wijze het 2′-O-ribosegebied met zijn aminogroepen nabij het 2′-ribosegebied waar het zwavelatoom van SAM zich anders zou bevinden.

De SAM-kloof had twee uiteinden, waarvan het ene uiteinde, grenzend aan de RNA-pocket, cruciaal was voor het positioneren van SAM voor methyltransferasereacties, en het andere uiteinde, gelegen naast de adeninebasis van sinefungine, onbezet was. Nader onderzoek onthulde een complex netwerk van watermoleculen op de locatie, verbonden door waterstofbruggen en gebonden aan residuen Glu118, Asn156 en Val116, evenals aan de adeninegroep.

Sinefungin-scaffoldmoleculen met delen die de watermoleculen zouden kunnen verdringen en rechtstreeks zouden kunnen interageren met de Glu118-, Asn156- en Val116-residuen zouden uitzonderlijk goede bindmiddelen kunnen zijn omdat de verplaatsing van de watermoleculen gunstige entropische effecten zou kunnen veroorzaken. De gelijkenis van de MPXV SAM-bindingsplaats met Zika en SARS-CoV-2 was opvallend. Er werden identieke conformaties waargenomen tussen sinefungine en de NS5-, nsp16- en VP39-eiwitten van respectievelijk Zika, SARS-CoV-2 en MPXV.

De katalytische residu-tetrad (Asp138, Lys41, Glu218 en Lys175) voor MPXV was geconserveerd onder de drie geteste afgelegen virussen, inclusief de residu-conformaties. Bovendien gebruikten alle virussen een aspartaatresidu om te interageren met de aminogroep van sinefungine. De geconserveerde bindingsmodi tussen de drie virussen suggereerden dat een enkele MTase-remmer mogelijk als pan-antiviraal middel zou kunnen worden gebruikt. Er werden echter verschillen in de bindingsmodi van de nucleobasen en de ribosering waargenomen.

Over het geheel genomen toonden de onderzoeksresultaten aan dat op MTase gebaseerde remmers pan-antivirale doelwitten zouden kunnen zijn.

Dit nieuwsartikel was een recensie van een voorlopig wetenschappelijk rapport dat op het moment van publicatie nog niet door vakgenoten was beoordeeld. Sinds de eerste publicatie is het wetenschappelijk rapport nu peer-reviewed en geaccepteerd voor publicatie in een academisch tijdschrift. Links naar de voorlopige en peer-reviewed rapporten zijn te vinden in de sectie Bronnen aan het einde van dit artikel. Bekijk bronnen

Referenties:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Jan Silhan, Martin Klima, Dominika Chalupska, Jan Kozic, Evzen Boura. (2022). Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.27.509668 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.27.509668v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Silhan, Jan, Martin Klima, Tomas Otava, Petr Skvara, Dominika Chalupska, Karel Chalupsky, Jan Kozic, Radim Nencka und Evzen Boura. 2023. „Entdeckung und strukturelle Charakterisierung von Monkeypox-Virus-Methyltransferase-VP39-Inhibitoren zeigen Ähnlichkeiten mit SARS-CoV-2-Nsp14-Methyltransferase.“ Naturkommunikation 14 (1). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38019-1. https://www.nature.com/articles/s41467-023-38019-1.

Artikelrevisies

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.