Strukturell analyse av monkeypox-virus for å veilede utviklingen av omfattende antivirale midler

Strukturell analyse av monkeypox-virus for å veilede utviklingen av omfattende antivirale midler

I en fersk studie publisert i bioRxiv * Preprint-server: Forskere undersøkte den krystallinske strukturen til monkeypox-virus (MPX) (MPXV) og komplekset av VP39, en 2'-O-RNA-metyltransferase (MTase), og sinefungin, en pan-MTase-hemmer.

Studie: Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. Bildnachweis: Marina Demidiuk/Shutterstock

Denne nyhetsartikkelen var en gjennomgang av en foreløpig vitenskapelig rapport som ikke hadde blitt fagfellevurdert på publiseringstidspunktet. Siden den første publiseringen har den vitenskapelige rapporten nå blitt fagfellevurdert og akseptert for publisering i et akademisk tidsskrift. Lenker til de foreløpige og fagfellevurderte rapportene finner du i Kilder-delen på slutten av denne artikkelen. Se kilder

Antallet MPX-tilfeller øker hver time over hele verden og kan indikere en ny pandemi. Strukturell analyse av MPXV kan være nyttig for å utvikle effektive antivirale midler for å bekjempe MPXV. Poxvirus koder for enzymer av decapping-typen for å forhindre akkumulering av dobbelttrådet ribonukleinsyre (dsRNA) under infeksjon, noe som kan utløse medfødte antivirale immunresponser. MPXV koder for pox-enzymet, som hemmer cGAS-STING (syklisk GMP-AMP-syntasestimulator av interferon-gener)-banen utløst av ds-deoksyribonukleinsyre (dsDNA).

Metylering av det innledende nukleotidet (nt) til den modne MPXV-hetten (eller cap-1) ved 2'-O-ribose-posisjonen ble dokumentert. MTase kreves av Poxviridiae-familien av virus (inkludert MPXV) for cap-0-syntese, og ved å legge til en annen metylgruppe i 2′-O-posisjonen til den proksimale ribosen, kan den umodne cap (cap-0) omdannes til den modne cap. Trinnet er viktig for å forhindre utvikling av medfødte immunresponser og katalyseres av VP39, 2′-O MTase av MPXV.

Om studiet

I denne studien undersøkte forskere VP39-sinefungin-kompleksstrukturen til MPXV for å forbedre forståelsen av mekanismene for hemming av VP39-molekylet av sinefungin. De sammenlignet også strukturen med 2′-O-MTaser fra enkelttrådede RNA-virus (ssRNA) som Zika-virus og alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2).

VP39-genet til MPXV USA-May22-stammen ble kodonoptimalisert for ekspresjon i E. coli for påfølgende syntese og kloning. E. coli BL21-celler ble transformert med VP39-uttrykkende plasmid og IPTG (isopropyl-bD-tiogalaktopyranosid) ble tilsatt, etterfulgt av rensing av det rekombinante VP39. Cellene ble sentrifugert, lysert, og lysatet ble underkastet kromatografisk analyse. VP39 ble konsentrert og blandet med sinefungin for krystalliseringsbaserte eksperimenter.

De opprinnelig dannede krystallene ble knust og frøsikter og RNA-substrater ble fremstilt ved in vitro-transkripsjon. Deretter ble 2´-O-MTase-analyser og ekkomassespektrometriske analyser utført. Hastigheten av MTase-aktivitet, 2′-O-MTase-hemming av sinefungin og substratomdannelseshastigheter (SAM) ble bestemt, og de halvmaksimale hemmende konsentrasjonsverdiene (IC50) ble bestemt.

Det krystallografiske datasettet til de oppnådde diffraksjonskrystallene ble analysert. De strukturelle egenskapene til VP39/sinefungin-komplekset ble undersøkt ved bruk av den molekylære substitusjonsmetoden med vacciniavirus VP39/SAH-kompleksstrukturen som søkemodell. For å undersøke den enzymatiske aktiviteten til rekombinant VP39, ble to substrater med forskjellige nest siste baser (m7GpppA RNA og m7GpppG RNA) testet.

VP39-sinefungin-interaksjonene ble analysert ved å bygge en modell av sinefungin:RNA:VP39-komplekset for å illustrere de molekylære mekanismene som ligger til grunn for VP39-hemming av sinefungin. I tillegg ble de katalytiske stedene til VP39 sammenlignet med de til 2′-O-ribose MTaser fra fjerne Zika-virus og SARS-CoV-2.

Resultater

MPX-strukturen omfattet en Rossman-fold som ligner alfa/beta-folden (α/β), med det sentralt plasserte β-arket som spenner over β2-β10 i et mønster som ligner J-bokstaven. Spesielt ble mønsteret også funnet for 2′-O MTase ikke-strukturelt protein (nsp) 1614 av SARS-CoV-2. Det sentrale β-arket ble festet i den ene enden av alfa-1-, alfa2-, alfa-6- og alfa-7-spiraler og i den andre enden med alfa-3- og alfa-7-heliksene, og sidene var forbundet med β1. β11 og α5.

Begge RNAS-substratene ble funnet å være akseptable; men den med en nest siste guaninbase var å foretrekke. Sinefungin hemmet VP39 med en IC50-verdi på 41 µM. Sinefungin ble funnet å okkupere SAM-lommen med sin adeninbasedel lokalisert i en dyp canyon foret av hydrogenbundne hydrofobe sidekjeder av Val116-, Phe115-, Leu159- og Val139-restene. Sinefungin beskyttet effektivt 2'-O-ribose-regionen med sine aminogrupper nær 2'-ribose-regionen der svovelatomet til SAM ellers ville vært lokalisert.

SAM-kløften hadde to ender, hvorav den ene enden, ved siden av RNA-lommen, var avgjørende for å plassere SAM for metyltransferasereaksjoner, og den motsatte enden, som ligger ved siden av adeninbasen til sinefungin, var ubesatt. Nærmere inspeksjon avslørte et komplekst nettverk av vannmolekyler på stedet, forbundet med hydrogenbindinger og bundet til restene Glu118, Asn156 og Val116 samt adenindelen.

Sinefungin stillasmolekyler med deler som kan fortrenge vannmolekylene og samhandle direkte med Glu118-, Asn156- og Val116-restene kan være eksepsjonelt gode bindemidler fordi forskyvningen av vannmolekylene kan gi gunstige entropiske effekter. Likheten mellom MPXV SAM-bindingsstedet til Zika og SARS-CoV-2 var slående. Identiske konformasjoner ble observert mellom sinefungin og NS5-, nsp16- og VP39-proteinene til henholdsvis Zika, SARS-CoV-2 og MPXV.

Den katalytiske resttetraden (Asp138, Lys41, Glu218 og Lys175) for MPXV ble konservert blant de tre fjerntliggende virusene som ble testet, inkludert restkonformasjonene. I tillegg brukte alle virus en aspartatrest for å samhandle med aminogruppen til sinefungin. De konserverte bindingsmåtene mellom de tre virusene antydet at en enkelt MTase-hemmer potensielt kunne brukes som et pan-antiviralt middel. Imidlertid ble forskjeller i bindingsmodusene til nukleobasene og riboseringen observert.

Samlet sett viste studieresultatene at MTase-baserte hemmere kan være pan-antivirale mål.

Denne nyhetsartikkelen var en gjennomgang av en foreløpig vitenskapelig rapport som ikke hadde blitt fagfellevurdert på publiseringstidspunktet. Siden den første publiseringen har den vitenskapelige rapporten nå blitt fagfellevurdert og akseptert for publisering i et akademisk tidsskrift. Lenker til de foreløpige og fagfellevurderte rapportene finner du i Kilder-delen på slutten av denne artikkelen. Se kilder

Referanser:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Jan Silhan, Martin Klima, Dominika Chalupska, Jan Kozic, Evzen Boura. (2022). Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.27.509668 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.27.509668v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Silhan, Jan, Martin Klima, Tomas Otava, Petr Skvara, Dominika Chalupska, Karel Chalupsky, Jan Kozic, Radim Nencka und Evzen Boura. 2023. „Entdeckung und strukturelle Charakterisierung von Monkeypox-Virus-Methyltransferase-VP39-Inhibitoren zeigen Ähnlichkeiten mit SARS-CoV-2-Nsp14-Methyltransferase.“ Naturkommunikation 14 (1). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38019-1. https://www.nature.com/articles/s41467-023-38019-1.

Artikkelrevisjoner

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.