Análise estrutural do vírus da varíola dos macacos para orientar o desenvolvimento de agentes antivirais abrangentes

Análise estrutural do vírus da varíola dos macacos para orientar o desenvolvimento de agentes antivirais abrangentes

Num estudo recente publicado em bioRxiv * Servidor de pré-impressão: Os pesquisadores examinaram a estrutura cristalina do vírus da varíola dos macacos (MPX) (MPXV) e o complexo de VP39, uma 2′-O-RNA metiltransferase (MTase), e sinefungina, um inibidor pan-MTase.

Studie: Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. Bildnachweis: Marina Demidiuk/Shutterstock

Esta notícia foi uma revisão de um relatório científico preliminar que não havia sido revisado por pares no momento da publicação. Desde a sua publicação inicial, o relatório científico foi agora revisto por pares e aceite para publicação numa revista académica. Links para os relatórios preliminares e revisados ​​por pares podem ser encontrados na seção Fontes no final deste artigo. Ver fontes

O número de casos de MPX aumenta a cada hora em todo o mundo e pode indicar uma nova pandemia. A análise estrutural do MPXV pode ser útil no desenvolvimento de agentes antivirais eficazes para combater o MPXV. Os poxvírus codificam enzimas do tipo decapagem para prevenir o acúmulo de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) durante a infecção, o que poderia desencadear respostas imunes antivirais inatas. MPXV codifica a enzima varíola, que inibe a via cGAS-STING (estimulador cíclico da sintase GMP-AMP dos genes do interferon) desencadeada pelo ácido ds-desoxirribonucléico (dsDNA).

A metilação do nucleotídeo inicial (nt) do cap MPXV maduro (ou cap-1) na posição 2'-O-ribose foi documentada. A MTase é exigida pela família de vírus Poxviridiae (incluindo MPXV) para a síntese de cap-0 e adicionando outro grupo metil na posição 2'-O da ribose proximal, a capa imatura (cap-0) pode ser convertida na capa madura. A etapa é importante para prevenir o desenvolvimento de respostas imunes inatas e é catalisada por VP39, a 2′-O MTase do MPXV.

Sobre o estudo

No presente estudo, os pesquisadores examinaram a estrutura do complexo VP39-sinefungina do MPXV para melhorar a compreensão dos mecanismos de inibição da molécula VP39 pela sinefungina. Eles também compararam a estrutura com 2′-O-MTases de vírus de RNA de fita simples (ssRNA), como o vírus Zika e o coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2).

O gene VP39 da cepa MPXV USA-May22 foi otimizado por códon para expressão em E. coli para posterior síntese e clonagem. Células E. coli BL21 foram transformadas com plasmídeo que expressa VP39 e foi adicionado IPTG (isopropil-bD-tiogalactopiranósido), seguido de purificação do VP39 recombinante. As células foram centrifugadas, lisadas e o lisado foi submetido a análise cromatográfica. O VP39 foi concentrado e misturado com sinefungina para experimentos baseados em cristalização.

Os cristais inicialmente formados foram triturados e peneiras de sementes e substratos de RNA foram preparados por transcrição in vitro. Posteriormente, foram realizados ensaios de 2´-O-MTase e análises de ecoespectrometria de massa. A taxa de atividade da MTase, a inibição da 2'-O-MTase pela sinefungina e as taxas de conversão de substrato (SAM) foram determinadas, e os valores da concentração inibitória semimáxima (IC50) foram determinados.

O conjunto de dados cristalográficos dos cristais de difração obtidos foi analisado. As características estruturais do complexo VP39/sinefungina foram examinadas utilizando o método de substituição molecular com a estrutura do complexo VP39/SAH do vírus vaccinia como modelo de pesquisa. Para examinar a atividade enzimática do VP39 recombinante, foram testados dois substratos com penúltimas bases diferentes (RNA m7GpppA e RNA m7GpppG).

As interações VP39-sinefungina foram analisadas através da construção de um modelo do complexo sinefungina:RNA:VP39 para ilustrar os mecanismos moleculares subjacentes à inibição de VP39 pela sinefungina. Além disso, os locais catalíticos do VP39 foram comparados com os das MTases 2'-O-ribose de vírus Zika distantes e SARS-CoV-2.

Resultados

A estrutura MPX compreendia uma dobra de Rossman semelhante à dobra alfa/beta (α/β), com a folha β localizada centralmente abrangendo β2-β10 em um padrão semelhante à letra J. Notavelmente, o padrão também foi encontrado para a proteína não estrutural 2′-O MTase (nsp)1614 do SARS-CoV-2. A folha β central foi fixada em uma extremidade pelas hélices alfa-1, alfa2, alfa-6 e alfa-7 e na outra extremidade pelas hélices alfa-3 e alfa-7, e os lados foram conectados por β1. β11 e α5.

Ambos os substratos de RNAS foram considerados aceitáveis; entretanto, aquele com penúltima base de guanina era preferível. A sinefungina inibiu o VP39 com um valor IC50 de 41 µM. Verificou-se que a sinefungina ocupa a bolsa SAM com a sua porção base de adenina localizada num desfiladeiro profundo revestido por cadeias laterais hidrofóbicas ligadas a hidrogénio dos resíduos Val116, Phe115, Leu159 e Val139. A sinefungina protegeu eficientemente a região 2'-O-ribose com os seus grupos amino perto da região 2'-ribose onde o átomo de enxofre do SAM estaria localizado.

O desfiladeiro do SAM tinha duas extremidades, das quais uma extremidade, adjacente à bolsa de RNA, era crucial para o posicionamento do SAM para reações de metiltransferase, e a extremidade oposta, localizada próxima à base de adenina da sinefungina, estava desocupada. Uma inspeção mais detalhada revelou uma rede complexa de moléculas de água no local, conectadas por ligações de hidrogênio e ligadas aos resíduos Glu118, Asn156 e Val116, bem como à porção adenina.

Moléculas de estrutura de sinefungina com porções que poderiam deslocar as moléculas de água e interagir diretamente com os resíduos Glu118, Asn156 e Val116 poderiam ser ligantes excepcionalmente bons porque o deslocamento das moléculas de água poderia produzir efeitos entrópicos favoráveis. A semelhança do sítio de ligação do MPXV SAM com o Zika e o SARS-CoV-2 foi impressionante. Conformações idênticas foram observadas entre a sinefungina e as proteínas NS5, nsp16 e VP39 do Zika, SARS-CoV-2 e MPXV, respectivamente.

A tétrade do resíduo catalítico (Asp138, Lys41, Glu218 e Lys175) para MPXV foi conservada entre os três vírus remotos testados, incluindo as conformações dos resíduos. Além disso, todos os vírus utilizaram um resíduo de aspartato para interagir com o grupo amino da sinefungina. Os modos de ligação conservados entre os três vírus sugeriram que um único inibidor de MTase poderia potencialmente ser usado como agente pan-antiviral. No entanto, foram observadas diferenças nos modos de ligação das nucleobases e do anel ribose.

No geral, os resultados do estudo mostraram que os inibidores baseados em MTase poderiam ser alvos pan-antivirais.

Esta notícia foi uma revisão de um relatório científico preliminar que não havia sido revisado por pares no momento da publicação. Desde a sua publicação inicial, o relatório científico foi agora revisto por pares e aceite para publicação numa revista académica. Links para os relatórios preliminares e revisados ​​por pares podem ser encontrados na seção Fontes no final deste artigo. Ver fontes

Referências:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Jan Silhan, Martin Klima, Dominika Chalupska, Jan Kozic, Evzen Boura. (2022). Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.27.509668 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.27.509668v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Silhan, Jan, Martin Klima, Tomas Otava, Petr Skvara, Dominika Chalupska, Karel Chalupsky, Jan Kozic, Radim Nencka und Evzen Boura. 2023. „Entdeckung und strukturelle Charakterisierung von Monkeypox-Virus-Methyltransferase-VP39-Inhibitoren zeigen Ähnlichkeiten mit SARS-CoV-2-Nsp14-Methyltransferase.“ Naturkommunikation 14 (1). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38019-1. https://www.nature.com/articles/s41467-023-38019-1.

Revisões de artigos

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.