Strukturna analiza virusa opičjih koz za vodenje razvoja celovitih protivirusnih učinkovin

Strukturna analiza virusa opičjih koz za vodenje razvoja celovitih protivirusnih učinkovin

V nedavni študiji, objavljeni v bioRxiv * Strežnik prednatisa: Raziskovalci so pregledali kristalno strukturo virusa opičjih koz (MPX) (MPXV) in kompleks VP39, 2'-O-RNA metiltransferaze (MTase), in sinefungina, zaviralca pan-MTase.

Studie: Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. Bildnachweis: Marina Demidiuk/Shutterstock

Ta članek je bil pregled predhodnega znanstvenega poročila, ki v času objave ni bilo strokovno pregledano. Od prve objave je bilo znanstveno poročilo strokovno pregledano in sprejeto za objavo v akademski reviji. Povezave do predhodnih in strokovno pregledanih poročil lahko najdete v razdelku Viri na koncu tega članka. Ogled virov

Število primerov MPX narašča vsako uro po vsem svetu in bi lahko pomenilo novo pandemijo. Strukturna analiza MPXV bi lahko bila v pomoč pri razvoju učinkovitih protivirusnih sredstev za boj proti MPXV. Poksvirusi kodirajo encime dekaping tipa, da preprečijo kopičenje dvojnoverižne ribonukleinske kisline (dsRNA) med okužbo, kar bi lahko sprožilo prirojene protivirusne imunske odzive. MPXV kodira encim pox, ki zavira pot cGAS-STING (ciklični GMP-AMP sintazni stimulator interferonskih genov), ki jo sproži ds-deoksiribonukleinska kislina (dsDNA).

Dokumentirana je bila metilacija začetnega nukleotida (nt) zrele kapice MPXV (ali cap-1) na položaju 2'-O-riboze. Družina virusov Poxviridiae (vključno z MPXV) potrebuje MTazo za sintezo cap-0 in z dodajanjem druge metilne skupine na položaju 2′-O proksimalne riboze se lahko nezrela kapica (cap-0) pretvori v zrelo kapico. Ta korak je pomemben za preprečevanje razvoja prirojenih imunskih odzivov in ga katalizira VP39, 2'-O MTaza MPXV.

O študiju

V tej študiji so raziskovalci pregledali strukturo kompleksa VP39-sinefungin MPXV, da bi izboljšali razumevanje mehanizmov zaviranja molekule VP39 s sinefunginom. Strukturo so primerjali tudi z 2'-O-MTazami iz virusov enoverižne RNA (ssRNA), kot sta virus Zika in koronavirus 2 hudega akutnega respiratornega sindroma (SARS-CoV-2).

Gen VP39 seva MPXV USA-May22 je bil kodon optimiziran za izražanje v E. coli za kasnejšo sintezo in kloniranje. Celice E. coli BL21 smo transformirali s plazmidom, ki izraža VP39, in dodali IPTG (izopropil-bD-tiogalaktopiranozid), čemur je sledilo čiščenje rekombinantnega VP39. Celice smo centrifugirali, lizirali in lizat podvrgli kromatografski analizi. VP39 je bil koncentriran in zmešan s sinefunginom za poskuse na osnovi kristalizacije.

Prvotno oblikovane kristale smo zdrobili in z in vitro transkripcijo pripravili semena in substrate RNA. Nato so bili izvedeni testi 2´-O-MTaze in analize eho masne spektrometrije. Določene so bile stopnja aktivnosti MTaze, inhibicija 2'-O-MTaze s sinefunginom in stopnje pretvorbe substrata (SAM) ter vrednosti polovične največje inhibitorne koncentracije (IC50).

Analiziran je bil nabor kristalografskih podatkov dobljenih difrakcijskih kristalov. Strukturne značilnosti kompleksa VP39/sinefungin so bile preučene z uporabo metode molekularne substitucije s strukturo kompleksa virusa vakcinije VP39/SAH kot iskalnega modela. Za preučitev encimske aktivnosti rekombinantnega VP39 smo testirali dva substrata z različnimi predzadnjimi bazami (m7GpppA RNA in m7GpppG RNA).

Interakcije VP39-sinefungin so bile analizirane z izdelavo modela kompleksa sinefungin:RNA:VP39 za ponazoritev molekularnih mehanizmov, na katerih temelji inhibicija VP39 s sinefunginom. Poleg tega so katalitična mesta VP39 primerjali s tistimi 2′-O-riboze MTaze iz oddaljenih virusov Zika in SARS-CoV-2.

Rezultati

Struktura MPX je vključevala Rossmanovo gubo, podobno gubi alfa/beta (α/β), s sredinsko nameščenim β-listom, ki je zajemal β2-β10 v vzorcu, ki spominja na črko J. Predvsem je bil vzorec najden tudi za nestrukturni protein 2′-O MTase (nsp)1614 SARS-CoV-2. Osrednji β-list je bil na enem koncu pritrjen s vijačnicami alfa-1, alfa2, alfa-6 in alfa-7, na drugem koncu pa z vijačnicami alfa-3 in alfa-7, stranice pa so bile povezane z β1. β11 in α5.

Ugotovljeno je bilo, da sta oba substrata RNAS sprejemljiva; vendar je bil boljši tisti s predzadnjo bazo gvanina. Sinefungin je zaviral VP39 z vrednostjo IC50 41 µM. Ugotovljeno je bilo, da sinefungin zaseda žep SAM s svojim delom adeninske baze, ki se nahaja v globokem kanjonu, obrobljenem z vodikovimi vezmi hidrofobnih stranskih verig ostankov Val116, Phe115, Leu159 in Val139. Sinefungin je učinkovito zaščitil regijo 2'-O-riboze s svojimi amino skupinami v bližini regije 2'-riboze, kjer bi se sicer nahajal žveplov atom SAM.

Soteska SAM je imela dva konca, od katerih je bil en konec, ki meji na žep RNA, ključen za pozicioniranje SAM za reakcije metiltransferaze, nasprotni konec, ki se nahaja poleg adeninske baze sinefungina, pa je bil nezaseden. Natančnejši pregled je razkril zapleteno mrežo vodnih molekul na mestu, povezanih z vodikovimi vezmi in vezanih na ostanke Glu118, Asn156 in Val116 ter na adeninski del.

Molekule ogrodja sinefungina z deli, ki bi lahko izpodrivali molekule vode in neposredno vplivali na ostanke Glu118, Asn156 in Val116, bi lahko bile izjemno dobra veziva, ker bi lahko izpodrivanje molekul vode povzročilo ugodne entropijske učinke. Podobnost mesta vezave MPXV SAM z Ziko in SARS-CoV-2 je bila osupljiva. Enake konformacije so opazili med sinefunginom in proteini NS5, nsp16 in VP39 virusa Zika, SARS-CoV-2 oziroma MPXV.

Tetrad katalitskega ostanka (Asp138, Lys41, Glu218 in Lys175) za MPXV je bil ohranjen med tremi oddaljenimi testiranimi virusi, vključno s konformacijami ostankov. Poleg tega so vsi virusi uporabili ostanek aspartata za interakcijo z amino skupino sinefungina. Ohranjeni načini vezave med tremi virusi so nakazovali, da bi lahko en sam inhibitor MTaze potencialno uporabili kot pan-protivirusno sredstvo. Vendar so opazili razlike v načinih vezave nukleobaz in riboznega obroča.

Na splošno so rezultati študije pokazali, da so zaviralci na osnovi MTase lahko pan-protivirusne tarče.

Ta članek je bil pregled predhodnega znanstvenega poročila, ki v času objave ni bilo strokovno pregledano. Od prve objave je bilo znanstveno poročilo strokovno pregledano in sprejeto za objavo v akademski reviji. Povezave do predhodnih in strokovno pregledanih poročil lahko najdete v razdelku Viri na koncu tega članka. Ogled virov

Reference:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Jan Silhan, Martin Klima, Dominika Chalupska, Jan Kozic, Evzen Boura. (2022). Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.27.509668 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.27.509668v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Silhan, Jan, Martin Klima, Tomas Otava, Petr Skvara, Dominika Chalupska, Karel Chalupsky, Jan Kozic, Radim Nencka und Evzen Boura. 2023. „Entdeckung und strukturelle Charakterisierung von Monkeypox-Virus-Methyltransferase-VP39-Inhibitoren zeigen Ähnlichkeiten mit SARS-CoV-2-Nsp14-Methyltransferase.“ Naturkommunikation 14 (1). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38019-1. https://www.nature.com/articles/s41467-023-38019-1.

Revizije člankov

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.