猴痘病毒的结构分析指导综合抗病毒药物的开发

猴痘病毒的结构分析指导综合抗病毒药物的开发

在最近发表的一项研究中 生物Rxiv * 预印本服务器：研究人员检查了猴痘病毒 (MPX) (MPXV) 的晶体结构以及 VP39（一种 2'-O-RNA 甲基转移酶 (MTase)）和 Sinefungin（一种泛 MTase 抑制剂）的复合物。

Studie: Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. Bildnachweis: Marina Demidiuk/Shutterstock

这篇新闻文章是对初步科学报告的评论，该报告在发表时尚未经过同行评审。 自首次发表以来，该科学报告现已经过同行评审并接受在学术期刊上发表。 初步报告和同行评审报告的链接可以在本文末尾的“来源”部分找到。 查看来源

全球 MPX 病例数量每小时都在增加，可能预示着新的大流行。 MPXV 的结构分析可能有助于开发有效的抗病毒药物来对抗 MPXV。 痘病毒编码脱帽型酶，以防止感染期间双链核糖核酸 (dsRNA) 的积累，从而引发先天抗病毒免疫反应。 MPXV 编码痘酶，该酶抑制由 ds-脱氧核糖核酸 (dsDNA) 触发的 cGAS-STING（干扰素基因的环 GMP-AMP 合酶刺激剂）途径。

记录了成熟 MPXV cap（或 cap-1）的 2'-O-核糖位置的初始核苷酸 (nt) 的甲基化。 痘病毒科病毒（包括 MPXV）需要 MTase 来合成 cap-0，通过在近端核糖的 2'-O 位置添加另一个甲基，可以将不成熟的帽 (cap-0) 转化为成熟的帽。 该步骤对于防止先天免疫反应的发展非常重要，并由 VP39（MPXV 的 2'-O MTase）催化。

关于该研究

在本研究中，研究人员检查了 MPXV 的 VP39-sinefungin 复合物结构，以加深对 sinefungin 抑制 VP39 分子机制的了解。 他们还将该结构与寨卡病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 等单链 RNA 病毒 (ssRNA) 的 2′-O-MTase 进行了比较。

MPXV USA-May22 菌株的 VP39 基因经过密码子优化，可在大肠杆菌中表达，以便随后合成和克隆。 用表达VP39的质粒转化大肠杆菌BL21细胞，并添加IPTG（异丙基-bD-硫代半乳糖苷），然后纯化重组VP39。 将细胞离心、裂解，并对裂解物进行色谱分析。 浓缩 VP39 并与辛芬净混合用于基于结晶的实验。

将最初形成的晶体粉碎，并通过体外转录制备种子筛和RNA底物。 随后，进行了 2´-O-MTase 测定和回波质谱分析。 测定MTase活性率、辛芬净对2′-O-MTase抑制率和底物转化率（SAM），并测定半数抑制浓度（IC50）值。

分析所获得的衍射晶体的晶体学数据集。 以痘苗病毒VP39/SAH复合物结构为搜索模型，采用分子取代法考察了VP39/辛芬净复合物的结构特征。 为了检查重组 VP39 的酶活性，测试了具有不同倒数第二个碱基的两种底物（m7GpppA RNA 和 m7GpppG RNA）。

通过建立 sinefungin:RNA:VP39 复合物模型来分析 VP39-sinefungin 相互作用，以说明 sinefungin 抑制 VP39 的分子机制。 此外，还将 VP39 的催化位点与来自遥远的寨卡病毒和 SARS-CoV-2 的 2'-O-核糖 MTase 的催化位点进行了比较。

结果

MPX 结构包含类似于 α/β 折叠 (α/β) 的罗斯曼折叠，其中位于中心的 β 折叠以类似于 J 字母的模式跨越 β2-β10。 值得注意的是，SARS-CoV-2 的 2'-O MTase 非结构蛋白 (nsp)1614 也发现了这种模式。 中央β-折叠一端由α-1、α2、α-6和α-7螺旋连接，另一端由α-3和α-7螺旋连接，两侧由β1连接。 β11 和 α5。

两种 RNAS 底物都被发现是可接受的； 然而，具有倒数第二个鸟嘌呤碱基的碱基是优选的。 Sinefungin 抑制 VP39，IC50 值为 41 µM。 发现 Sinefungin 占据 SAM 口袋，其腺嘌呤碱基部分位于深峡谷中，该峡谷由 Val116、Phe115、Leu159 和 Val139 残基的氢键疏水侧链排列。 Sinefungin 有效地保护了 2'-O-核糖区域，其氨基位于 2'-核糖区域附近，否则 SAM 的硫原子将位于该区域。

SAM 峡谷有两端，其中一端靠近 RNA 口袋，对于甲基转移酶反应中 SAM 的定位至关重要，而另一端靠近 Sinefungin 的腺嘌呤碱基，则未被占据。 更仔细的检查显示该位点存在复杂的水分子网络，通过氢键连接并与残基 Glu118、Asn156 和 Val116 以及腺嘌呤部分结合。

Sinefungin 支架分子具有可以置换水分子并直接与 Glu118、Asn156 和 Val116 残基相互作用的部分，可能是非常好的粘合剂，因为水分子的置换可以产生有利的熵效应。 MPXV SAM 结合位点与寨卡病毒和 SARS-CoV-2 的相似性惊人。 在 Sinefungin 分别与寨卡病毒、SARS-CoV-2 和 MPXV 的 NS5、nsp16 和 VP39 蛋白之间观察到相同的构象。

MPXV 的催化残基四联体（Asp138、Lys41、Glu218 和 Lys175）在测试的三种远程病毒中是保守的，包括残基构象。 此外，所有病毒都使用天冬氨酸残基与辛芬净的氨基相互作用。 三种病毒之间保守的结合模式表明单一 MTase 抑制剂有可能用作泛抗病毒药物。 然而，观察到核碱基和核糖环的结合模式存在差异。

总体而言，研究结果表明基于 MTase 的抑制剂可能成为泛抗病毒靶点。

这篇新闻文章是对初步科学报告的评论，该报告在发表时尚未经过同行评审。 自首次发表以来，该科学报告现已经过同行评审并接受在学术期刊上发表。 初步报告和同行评审报告的链接可以在本文末尾的“来源”部分找到。 查看来源

参考：

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Jan Silhan, Martin Klima, Dominika Chalupska, Jan Kozic, Evzen Boura. (2022). Die Struktur der 2′-O-Ribose-Methyltransferase VP39 des Affenpockenvirus im Komplex mit Sinefungin bildet die Grundlage für das Inhibitordesign. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.27.509668 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.27.509668v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Silhan, Jan, Martin Klima, Tomas Otava, Petr Skvara, Dominika Chalupska, Karel Chalupsky, Jan Kozic, Radim Nencka und Evzen Boura. 2023. „Entdeckung und strukturelle Charakterisierung von Monkeypox-Virus-Methyltransferase-VP39-Inhibitoren zeigen Ähnlichkeiten mit SARS-CoV-2-Nsp14-Methyltransferase.“ Naturkommunikation 14 (1). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38019-1. https://www.nature.com/articles/s41467-023-38019-1.

文章修改

• 15. Mai 2023 – Das vorab gedruckte vorläufige Forschungspapier, auf dem dieser Artikel basiert, wurde zur Veröffentlichung in einer von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschrift angenommen. Dieser Artikel wurde entsprechend bearbeitet und enthält nun einen Link zum endgültigen, von Experten begutachteten Artikel, der jetzt im Abschnitt „Quellen“ angezeigt wird.