Studie ukazuje, že ACE-2 není biochemicky vyžadován pro membránovou fúzi SARS-CoV2

Studie ukazuje, že ACE-2 není biochemicky vyžadován pro membránovou fúzi SARS-CoV2

Studie zveřejněná v bioRxiv * Předtiskové servery testovaly hypotézu, že receptor angiotenzin-konvertujícího enzymu-2 (ACE-2) koronaviru 2 (SARS-CoV-2) není pouze připojovacím faktorem virových infekcí, ale také hraje roli při aktivaci virového spike proteinu pro usnadnění membránové fúze.

Studie: Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber für die SARS-CoV-2-Membranfusion biochemisch nicht erforderlich. Bildquelle: Kateryna Kon/Shutterstock

*Důležitá POZNÁMKA:bioRxiv publikuje předběžné vědecké zprávy, které nejsou recenzovány odborníky, a proto by neměly být považovány za přesvědčivé, zamýšlené jako vodítko pro klinickou praxi/chování související se zdravím nebo s nimiž se zachází jako s ověřenými informacemi.

pozadí

Virus SARS-CoV-2 infikuje lidské buňky pomocí hostitelova receptoru ACE-2. Virový spike protein kontroluje vstup a infekci SARS-CoV-2 vazbou na ACE-2 receptory na povrchu lidské buňky. ACE-2 je aktivován proteolytickým štěpením a řídí fúzi mezi buněčnou membránou a virovým obalem.

Důkazy ze studií naznačují, že ACE-2 nemusí sloužit pouze jako vazebný faktor, ale může také pomoci aktivovat spike protein SARS-CoV-2 pro membránovou fúzi. Lepší pochopení role ACE-2 v membránové fúzi může pomoci ilustrovat mechanismus infekce SARS-CoV-2 a předpovědět budoucí vývoj SARS-CoV-2 a dalších podobných virů.

Studie

V této studii vědci použili vazby deoxyribonukleové kyseliny (DNA)-lipid, protože se mohou nevratně vložit do membrán a umožnit programovatelné samosestavení.

Tento přístup umožňuje vložení komplementárních řetězců DNA konjugovaných s lipidy do virových částic, což umožňuje syntetickým lipozomům zacílit částice bez potřeby fyziologických receptorů. Spouštěče potřebné pro fúzi jsou poté chemicky rekonstituovány a testovány. Fúze je detekována pomocí jednovirové optické mikroskopie, kde jsou změny stavu viru během fúze sledovány pomocí fluorescenčních barviv. Výzkumníci již dříve používali přístup DNA-lipid tethering k charakterizaci virového vstupu různých rodin virů, včetně flavivirů a orthomyxovirů.

Výzkumníci použili syntetické lipozomy k měření na hrotech závislé vazby a fúze k syntetickým a buněčným membránám, aby zajistili nepřítomnost receptoru ACE-2. V experimentech byly použity tři špičky SARS-CoV-2 - D614G/N501Y, Wuhan a Omicron (B.1.1.529) - a dva typy virových částic - viru podobné částice (VLP) produkované expresí pseudovirů S, M, E a N proteinů na jádru HIV.

Tým samostatně inkuboval cílové membrány a virové částice s komplementárními řetězci DNA konjugovanými s lipidy DPPE. Imobilizovaly cílové membrány v mikrofluidní průtokové buňce, čímž umožnily virovým částicím vázat se.

Výsledky

Bylo zjištěno, že k fúzním událostem došlo pouze tehdy, když byly virové částice navázány na cílové membrány a byla přítomna proteáza. Fúze byla monitorována primárně pomocí lipidové směsi mezi cílovou membránou a virovou částicí a byla detekována zhášením barviva Texas Red ve virovém obalu, což vedlo ke zvýšení fluorescence. DNA-zprostředkovaná virová ACE-2 vazba byla specifická; Počet adsorbovaných částic se snížil více než 25krát, když byla vynechána DNA. Podobně nedošlo k žádné fúzi v nepřítomnosti exogenní proteázy.

Při srovnání kinetiky virové fúze hrotů Omicron a Wuhan pseudotypovaných na jádrech HIV a VLP Wuhan D614G/N501Y použitých v této studii tým zjistil, že zatímco oba pseudoviry měly podobnou rychlost fúze, VLP poskytovaly mírně, ale významně rychlejší rychlosti fúze.

Pozorovaný rozdíl v rychlosti fúze mohl být způsoben řadou faktorů, včetně variací v hustotě spike proteinu na VLP ve srovnání s jádrem HIV, E a M proteiny ve VLP, mutacemi D614G/N501Y a procentem aktivních spiků na povrchu VLP.

Když se proteáza použitá pro aktivaci měnila v experimentech Omicron a Wuhan, rychlosti fúze nebyly citlivé na koncentraci proteázy v rozmezí 200 až 1000 ug/ml. V souladu s předchozími zprávami nebyla transmembránová proteáza serin 2 (TMPRSS2) účinná při aktivaci omikronových špiček pro membránovou fúzi. V případě částic D614G/N501Y však přidání 40 μg/ml TMPRSS2 vedlo k jiné kinetice fúze než 200 μg/ml trypsinu.

Tato pozorování naznačují, že proteolytické štěpení nemusí být krokem omezujícím rychlost membránové fúze VLP vázaných na DNA, protože změna koncentrace proteázy by měla ovlivnit tvorbu komplexu enzym-substrát a změny v identitě proteázy by měly změnit kinetiku fúze.

Když byl rozpustný ACE-2 současně přidán k proteáze, bylo pozorováno významné zvýšení rychlosti kinetiky míšení lipidů ve Wuhanských a Omicronových spike experimentech. To ukazuje, že ačkoli konformace spike proteinu potřebné pro membránovou fúzi jsou dostupné bez ACE-2, ACE-2 receptor podporuje konformace spike, které podporují membránovou fúzi.

Diplom

Celkově výzkumníci zjistili, že pseudoviry SARS-CoV-2 a VLP nevyžadují ACE-2 pro membránovou fúzi, když jsou aktivovány vhodnou proteázou. Přidání rozpustného ACE-2 však urychlilo fúzní reakci u kmene Wuhan SARS-CoV-2 a varianty Omicron. Výsledky kinetické analýzy odhalily, že existují alespoň dva kroky omezující rychlost pro virovou membránovou fúzi. Jeden z kroků byl závislý na ACE-2, druhý ne.

Výše uvedené výsledky potvrzují, že receptor ACE-2 není biochemicky nezbytný pro membránovou fúzi SARS-CoV-2, pokud je přítomen alternativní vazebný faktor. Protože však ACE-2 funguje jako vysoce afinitní faktor pro připojení viru k lidským buňkám, jeho nahrazení jinými faktory připojení může ovlivnit vývoj SARS-CoV-2 a prostředí virové zdatnosti pro budoucí nově se objevující koronaviry.

*Důležitá POZNÁMKA:bioRxiv publikuje předběžné vědecké zprávy, které nejsou recenzovány odborníky, a proto by neměly být považovány za přesvědčivé, zamýšlené jako vodítko pro klinickou praxi/chování související se zdravím nebo s nimiž se zachází jako s ověřenými informacemi.

Odkaz:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Cervantes, M. et al. (2022) „Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber biochemisch nicht für die SARS-CoV-2-Membranfusion erforderlich.“ bioRxiv. doi: 10.1101/2022.10.22.513347. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.22.513347v1