Η μελέτη δείχνει ότι το ACE-2 δεν απαιτείται βιοχημικά για τη σύντηξη μεμβράνης SARS-CoV2

Η μελέτη δείχνει ότι το ACE-2 δεν απαιτείται βιοχημικά για τη σύντηξη μεμβράνης SARS-CoV2

Μια μελέτη που δημοσιεύτηκε στο bioRxiv * Οι διακομιστές προεκτύπωσης εξέτασαν την υπόθεση ότι ο υποδοχέας του μετατρεπτικού ενζύμου-2 (ACE-2) του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου του κορωνοϊού 2 (SARS-CoV-2) δεν είναι μόνο ένας δεσμευτικός παράγοντας στις ιογενείς λοιμώξεις αλλά παίζει επίσης ρόλο στην ενεργοποίηση της πρωτεΐνης ακίδας του ιού για τη διευκόλυνση της σύντηξης της μεμβράνης.

Studie: Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber für die SARS-CoV-2-Membranfusion biochemisch nicht erforderlich. Bildquelle: Kateryna Kon/Shutterstock

*Σημαντική ΣΗΜΕΙΩΣΗ:Το bioRxiv δημοσιεύει προκαταρκτικές επιστημονικές εκθέσεις που δεν έχουν αξιολογηθεί από ομοτίμους και επομένως δεν πρέπει να θεωρούνται πειστικές, που προορίζονται να καθοδηγήσουν την κλινική πρακτική/σχετική με την υγεία συμπεριφορά ή να αντιμετωπίζονται ως καθιερωμένες πληροφορίες.

φόντο

Ο ιός SARS-CoV-2 μολύνει ανθρώπινα κύτταρα χρησιμοποιώντας τον υποδοχέα ACE-2 του ξενιστή. Η πρωτεΐνη ακίδας του ιού ελέγχει την είσοδο και τη μόλυνση του SARS-CoV-2 δεσμεύοντας τους υποδοχείς ACE-2 στην επιφάνεια του ανθρώπινου κυττάρου. Το ACE-2 ενεργοποιείται με πρωτεολυτική διάσπαση και οδηγεί τη σύντηξη μεταξύ της κυτταρικής μεμβράνης και του περιβλήματος του ιού.

Τα στοιχεία από μελέτες υποδηλώνουν ότι το ACE-2 μπορεί όχι μόνο να χρησιμεύσει ως δεσμευτικός παράγοντας, αλλά μπορεί επίσης να βοηθήσει στην ενεργοποίηση της πρωτεΐνης ακίδας SARS-CoV-2 για σύντηξη μεμβράνης. Η καλύτερη κατανόηση του ρόλου του ACE-2 στη σύντηξη μεμβράνης μπορεί να βοηθήσει στην απεικόνιση του μηχανισμού πίσω από τη μόλυνση SARS-CoV-2 και στην πρόβλεψη της μελλοντικής εξέλιξης του SARS-CoV-2 και άλλων παρόμοιων ιών.

Η μελέτη

Στην παρούσα μελέτη, οι ερευνητές χρησιμοποίησαν δεσμούς δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος (DNA)-λιπιδίου επειδή μπορούν να εισέλθουν μη αναστρέψιμα στις μεμβράνες και να επιτρέψουν την προγραμματιζόμενη αυτοσυναρμολόγηση.

Αυτή η προσέγγιση επιτρέπει την εισαγωγή συμπληρωματικών κλώνων DNA συζευγμένων με λιπίδια σε ιικά σωματίδια, επιτρέποντας στα συνθετικά λιποσώματα να στοχεύουν τα σωματίδια χωρίς την ανάγκη για φυσιολογικούς υποδοχείς. Οι ενεργοποιητές που απαιτούνται για τη σύντηξη στη συνέχεια ανασυντίθενται χημικά και δοκιμάζονται. Η σύντηξη ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας οπτική μικροσκοπία ενός ιού, όπου οι αλλαγές στην κατάσταση του ιού κατά τη σύντηξη παρακολουθούνται χρησιμοποιώντας φθορίζουσες βαφές. Οι ερευνητές έχουν χρησιμοποιήσει προηγουμένως την προσέγγιση σύνδεσης DNA-λιπιδίων για να χαρακτηρίσουν την ιική είσοδο διαφόρων οικογενειών ιών, συμπεριλαμβανομένων των φλαβοϊών και των ορθομυξοϊών.

Οι ερευνητές χρησιμοποίησαν συνθετικά λιποσώματα για να μετρήσουν τη δέσμευση που εξαρτάται από την ακίδα και τη σύντηξη σε συνθετικές και κυτταρικές μεμβράνες για να εξασφαλίσουν την απουσία του υποδοχέα ACE-2. Τρεις αιχμές SARS-CoV-2 - D614G/N501Y, Wuhan και Omicron (B.1.1.529) - και δύο τύποι ιικών σωματιδίων - σωματίδια τύπου ιού (VLPs) που παράγονται από την έκφραση ψευδοϊών πρωτεϊνών S, M, E και N σε έναν πυρήνα HIV - χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα.

Η ομάδα επώασε χωριστά μεμβράνες-στόχους και σωματίδια ιού με συμπληρωματικούς κλώνους DNA συζευγμένους με λιπίδια DPPE. Ακινητοποίησαν τις μεμβράνες-στόχους σε ένα κύτταρο μικρορευστού ροής, επιτρέποντας έτσι τη δέσμευση των σωματιδίων του ιού.

Αποτελέσματα

Βρέθηκε ότι συμβάντα σύντηξης συνέβησαν μόνο όταν τα σωματίδια του ιού ήταν συνδεδεμένα με τις μεμβράνες-στόχους και ήταν παρούσα πρωτεάση. Η σύντηξη παρακολουθήθηκε κυρίως χρησιμοποιώντας το μίγμα λιπιδίων μεταξύ της μεμβράνης στόχου και του σωματιδίου του ιού και ανιχνεύτηκε με απόσβεση της βαφής Texas Red στο φάκελο του ιού, με αποτέλεσμα την ενίσχυση του φθορισμού. Η μεσολαβούμενη από DNA ιική δέσμευση ACE-2 ήταν ειδική. Ο αριθμός των προσροφημένων σωματιδίων μειώθηκε περισσότερο από 25 φορές όταν παραλείφθηκε το DNA. Ομοίως, δεν συνέβησαν συμβάντα σύντηξης απουσία εξωγενούς πρωτεάσης.

Κατά τη σύγκριση της ιικής κινητικής σύντηξης των αιχμών Omicron και Wuhan που ψευδότυποι στους πυρήνες HIV και των Wuhan D614G/N501Y VLP που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, η ομάδα διαπίστωσε ότι ενώ και οι δύο ψευδοϊοί είχαν παρόμοια ποσοστά σύντηξης, οι VLP έδωσαν ελαφρώς αλλά σημαντικά ταχύτερους ρυθμούς σύντηξης.

Η παρατηρούμενη διαφορά στους ρυθμούς σύντηξης θα μπορούσε να οφείλεται σε διάφορους παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των διακυμάνσεων στην πυκνότητα πρωτεΐνης ακίδας στα VLP σε σύγκριση με τον πυρήνα του HIV, τις πρωτεΐνες Ε και Μ στα VLP, τις μεταλλάξεις D614G/N501Y και το ενεργό ποσοστό αιχμής στην επιφάνεια του VLP.

Όταν η πρωτεάση που χρησιμοποιήθηκε για την ενεργοποίηση ποικίλλει στα πειράματα Omicron και Wuhan, οι ρυθμοί σύντηξης δεν ήταν ευαίσθητοι στη συγκέντρωση πρωτεάσης στην περιοχή από 200 έως 1000 μg/ml. Σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές, η διαμεμβρανική πρωτεάση σερίνη 2 (TMPRSS2) δεν ήταν αποτελεσματική στην ενεργοποίηση αιχμών όμικρον για σύντηξη μεμβράνης. Ωστόσο, στην περίπτωση των σωματιδίων D614G/N501Y, η προσθήκη 40 μg/mL TMPRSS2 οδήγησε σε διαφορετική κινητική σύντηξης από 200 μg/mL θρυψίνης.

Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι η πρωτεολυτική διάσπαση μπορεί να μην είναι το περιοριστικό βήμα για τη σύντηξη μεμβράνης των δεσμευμένων σε DNA VLPs επειδή μια αλλαγή στη συγκέντρωση πρωτεάσης θα πρέπει να επηρεάσει τον σχηματισμό του συμπλέγματος ενζύμου-υποστρώματος και οι αλλαγές στην ταυτότητα πρωτεάσης θα πρέπει να αλλάξουν την κινητική σύντηξης.

Όταν το διαλυτό ACE-2 προστέθηκε ταυτόχρονα στην πρωτεάση, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στον ρυθμό της κινητικής ανάμειξης των λιπιδίων στα πειράματα ακίδων Wuhan και Omicron. Αυτό δείχνει ότι αν και οι διαμορφώσεις πρωτεΐνης ακίδας που απαιτούνται για τη σύντηξη μεμβράνης είναι προσβάσιμες χωρίς ACE-2, ο υποδοχέας ACE-2 προάγει διαμορφώσεις ακίδων που ευνοούν τη σύντηξη μεμβράνης.

Δίπλωμα

Συνολικά, οι ερευνητές διαπίστωσαν ότι οι ψευδοϊοί SARS-CoV-2 και οι VLP δεν απαιτούν ACE-2 για τη σύντηξη μεμβράνης όταν ενεργοποιούνται με μια κατάλληλη πρωτεάση. Ωστόσο, η προσθήκη διαλυτού ACE-2 επιτάχυνε την αντίδραση σύντηξης στο στέλεχος Wuhan SARS-CoV-2 και στην παραλλαγή Omicron. Τα αποτελέσματα της κινητικής ανάλυσης αποκάλυψαν ότι υπάρχουν τουλάχιστον δύο στάδια περιορισμού του ρυθμού για τη σύντηξη της ιικής μεμβράνης. Ένα από τα βήματα ήταν εξαρτώμενο από το ACE-2, το άλλο όχι.

Τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι ο υποδοχέας ACE-2 δεν απαιτείται βιοχημικά για τη σύντηξη μεμβράνης SARS-CoV-2 όταν υπάρχει ένας εναλλακτικός παράγοντας δέσμευσης. Ωστόσο, δεδομένου ότι το ACE-2 λειτουργεί ως παράγοντας υψηλής συγγένειας για την προσκόλληση του ιού στα ανθρώπινα κύτταρα, η αντικατάστασή του με άλλους παράγοντες προσκόλλησης μπορεί να επηρεάσει την εξελικτικότητα του SARS-CoV-2 και το ιικό περιβάλλον φυσικής κατάστασης για μελλοντικούς αναδυόμενους κοροναϊούς.

*Σημαντική ΣΗΜΕΙΩΣΗ:Το bioRxiv δημοσιεύει προκαταρκτικές επιστημονικές εκθέσεις που δεν έχουν αξιολογηθεί από ομοτίμους και επομένως δεν πρέπει να θεωρούνται πειστικές, που προορίζονται να καθοδηγήσουν την κλινική πρακτική/σχετική με την υγεία συμπεριφορά ή να αντιμετωπίζονται ως καθιερωμένες πληροφορίες.

Αναφορά:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Cervantes, M. et al. (2022) „Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber biochemisch nicht für die SARS-CoV-2-Membranfusion erforderlich.“ bioRxiv. doi: 10.1101/2022.10.22.513347. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.22.513347v1