Uuring näitab, et ACE-2 ei ole SARS-CoV2 membraani liitmiseks biokeemiliselt vajalik

Uuring näitab, et ACE-2 ei ole SARS-CoV2 membraani liitmiseks biokeemiliselt vajalik

aastal avaldatud uuring bioRxiv * Preprindiserverid kontrollisid hüpoteesi, et raske ägeda respiratoorse sündroomi koronaviirus 2 (SARS-CoV-2) angiotensiini konverteeriva ensüüm-2 (ACE-2) retseptor ei ole mitte ainult viirusnakkuste siduv tegur, vaid mängib rolli ka viiruse spikevalgu aktiveerimisel, et hõlbustada membraani sulandumist.

Studie: Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber für die SARS-CoV-2-Membranfusion biochemisch nicht erforderlich. Bildquelle: Kateryna Kon/Shutterstock

*Oluline MÄRKUS:bioRxiv avaldab esialgseid teaduslikke aruandeid, mida ei ole eelretsenseeritud ja mida ei tohiks seetõttu pidada lõplikuks, mis on mõeldud kliinilise praktika/tervisega seotud käitumise suunamiseks ega käsitletud teabena.

taustal

SARS-CoV-2 viirus nakatab inimese rakke, kasutades peremeesorganismi ACE-2 retseptorit. Viiruse piigivalk kontrollib SARS-CoV-2 sisenemist ja nakatumist, seondudes inimese raku pinnal olevate ACE-2 retseptoritega. ACE-2 aktiveeritakse proteolüütilise lõhustamise teel ja see juhib sulandumist rakumembraani ja viiruse ümbrise vahel.

Uuringutest saadud tõendid näitavad, et ACE-2 ei pruugi toimida mitte ainult sidumisfaktorina, vaid võib samuti aidata aktiveerida SARS-CoV-2 spike-valku membraani liitmiseks. ACE-2 rolli parem mõistmine membraanide liitmisel võib aidata illustreerida SARS-CoV-2 nakkuse mehhanismi ja ennustada SARS-CoV-2 ja teiste sarnaste viiruste edasist arengut.

Uuring

Käesolevas uuringus kasutasid teadlased desoksüribonukleiinhappe (DNA)-lipiidsidemeid, kuna need võivad pöördumatult membraanidesse sisestada ja võimaldada programmeeritavat isekoostumist.

See lähenemisviis võimaldab viiruseosakestesse sisestada lipiididega konjugeeritud komplementaarseid DNA ahelaid, võimaldades sünteetilistel liposoomidel osakesi sihtida, ilma et oleks vaja füsioloogilisi retseptoreid. Sulandumiseks vajalikud päästikud taastatakse seejärel keemiliselt ja testitakse. Fusioon tuvastatakse ühe viiruse optilise mikroskoopia abil, kus viiruse oleku muutusi liitmise ajal jälgitakse fluorestsentsvärvide abil. Teadlased on varem kasutanud DNA-lipiidide sidumise meetodit erinevate viirusperekondade, sealhulgas flaviviiruste ja ortomüksoviiruste viiruse sisenemise iseloomustamiseks.

Teadlased kasutasid sünteetilisi liposoome, et mõõta piigist sõltuvat seondumist ja sulandumist sünteetiliste ja rakumembraanidega, et tagada ACE-2 retseptori puudumine. Katsetes kasutati kolme SARS-CoV-2 piiki – D614G/N501Y, Wuhan ja Omicron (B.1.1.529) – ning kahte viirusosakeste tüüpi – viiruselaadseid osakesi (VLP), mis on toodetud S-, M-, E- ja N-valkude pseudoviiruste ekspressioonil HIV tuumal.

Meeskond inkubeeris eraldi sihtmembraane ja viiruseosakesi koos DPPE lipiididega konjugeeritud komplementaarsete DNA ahelatega. Nad immobiliseerisid sihtmembraanid mikrofluidse voolu rakus, võimaldades seeläbi viiruseosakestel seonduda.

Tulemused

Leiti, et fusioonisündmused toimusid ainult siis, kui viiruseosakesed olid seotud sihtmembraanidega ja proteaasi olemasolu. Fusiooni jälgiti peamiselt lipiidide seguga sihtmembraani ja viiruseosakeste vahel ning tuvastati Texas Redi värvi kustutamisega viiruse ümbrises, mille tulemuseks oli fluorestsentsi tugevnemine. DNA-vahendatud viiruse ACE-2 seondumine oli spetsiifiline; DNA väljajätmisel vähenes adsorbeerunud osakeste arv enam kui 25 korda. Samuti ei toimunud eksogeense proteaasi puudumisel fusioonisündmusi.

Võrreldes HIV-südamikele pseudotüüpitud Omicroni ja Wuhani naelu ja selles uuringus kasutatud Wuhan D614G/N501Y VLP-de viiruse sulandumise kineetikat, leidis meeskond, et kuigi mõlemal pseudoviirusel oli sarnane sulandumiskiirus, andsid VLP-d veidi, kuid oluliselt kiirema sulandumiskiiruse.

Täheldatud erinevus fusioonikiirustes võib olla tingitud erinevatest teguritest, sealhulgas VLP-de valgu tiheduse erinevustest võrreldes HIV tuumaga, E- ja M-valkudega VLP-des, D614G/N501Y mutatsioonidega ja aktiivse naelu protsendiga VLP pinnal.

Kui aktiveerimiseks kasutatud proteaasi varieeriti Omicroni ja Wuhani katsetes, ei olnud fusioonikiirused proteaasi kontsentratsiooni suhtes vahemikus 200 kuni 1000 µg/ml tundlikud. Kooskõlas varasemate aruannetega ei olnud transmembraanne proteaas seriin 2 (TMPRSS2) efektiivne omikroniliste naelu aktiveerimisel membraani liitmiseks. D614G/N501Y osakeste puhul andis 40 μg/mL TMPRSS2 lisamine aga teistsuguse fusioonikineetika kui 200 μg/mL trüpsiinil.

Need tähelepanekud viitavad sellele, et proteolüütiline lõhustamine ei pruugi olla kiirust piirav etapp DNA-ga seotud VLP-de membraaniga liitmisel, kuna proteaasi kontsentratsiooni muutus peaks mõjutama ensüümi-substraadi kompleksi moodustumist ja proteaasi identsuse muutused peaksid muutma liitmise kineetikat.

Kui proteaasile lisati samaaegselt lahustuvat ACE-2, täheldati Wuhani ja Omicroni eksperimendis lipiidide segunemise kineetika olulist suurenemist. See näitab, et kuigi membraani sulandumiseks vajalikud spike-valgu konformatsioonid on kättesaadavad ilma ACE-2ta, soodustab ACE-2 retseptor spike konformatsioone, mis soodustavad membraani sulandumist.

Diplom

Üldiselt leidsid teadlased, et SARS-CoV-2 pseudoviirused ja VLP-d ei vaja membraani liitmiseks ACE-2, kui need aktiveeritakse sobiva proteaasiga. Lahustuva ACE-2 lisamine kiirendas aga fusioonireaktsiooni Wuhani SARS-CoV-2 tüves ja Omicroni variandis. Kineetilise analüüsi tulemused näitasid, et viiruse membraani liitmisel on vähemalt kaks kiirust piiravat etappi. Üks etappidest oli ACE-2-st sõltuv, teine ​​mitte.

Ülaltoodud tulemused kinnitavad, et ACE-2 retseptor ei ole SARS-CoV-2 membraani liitmiseks biokeemiliselt vajalik, kui esineb alternatiivne sidumisfaktor. Kuna aga ACE-2 toimib kõrge afiinsusega tegurina viiruse kinnitumisel inimese rakkudele, võib selle asendamine teiste kinnitusfaktoritega mõjutada SARS-CoV-2 arenemist ja viiruse sobivust tulevaste koroonaviiruste jaoks.

*Oluline MÄRKUS:bioRxiv avaldab esialgseid teaduslikke aruandeid, mida ei ole eelretsenseeritud ja mida ei tohiks seetõttu pidada lõplikuks, mis on mõeldud kliinilise praktika/tervisega seotud käitumise suunamiseks ega käsitletud teabena.

Viide:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Cervantes, M. et al. (2022) „Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber biochemisch nicht für die SARS-CoV-2-Membranfusion erforderlich.“ bioRxiv. doi: 10.1101/2022.10.22.513347. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.22.513347v1