Tutkimus osoittaa, että ACE-2:ta ei tarvita biokemiallisesti SARS-CoV2-kalvofuusiossa

Tutkimus osoittaa, että ACE-2:ta ei tarvita biokemiallisesti SARS-CoV2-kalvofuusiossa

Vuonna julkaistu tutkimus bioRxiv * Preprint-palvelimet testasivat hypoteesia, että vakava akuutti hengitystieoireyhtymä koronavirus 2 (SARS-CoV-2) angiotensiinia konvertoiva entsyymi-2 (ACE-2) -reseptori ei ole vain kiinnittymistekijä virusinfektioissa, vaan sillä on myös rooli viruksen piikkiproteiinin aktivoinnissa kalvon fuusioitumisen helpottamiseksi.

Studie: Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber für die SARS-CoV-2-Membranfusion biochemisch nicht erforderlich. Bildquelle: Kateryna Kon/Shutterstock

*Tärkeä HUOMAUTUS:bioRxiv julkaisee alustavia tieteellisiä raportteja, joita ei ole vertaisarvioitu ja joita ei siksi pitäisi pitää vakuuttavina, jotka on tarkoitettu ohjaamaan kliinistä käytäntöä/terveyteen liittyvää käyttäytymistä tai joita ei pitäisi käsitellä vakiintuneina tietoina.

tausta

SARS-CoV-2-virus infektoi ihmissoluja käyttämällä isännän ACE-2-reseptoria. Viruksen piikkiproteiini säätelee SARS-CoV-2:n sisäänpääsyä ja infektiota sitoutumalla ihmissolun pinnalla oleviin ACE-2-reseptoreihin. ACE-2 aktivoituu proteolyyttisellä katkaisulla ja ajaa fuusiota solukalvon ja virusvaipan välillä.

Tutkimuksista saadut todisteet viittaavat siihen, että ACE-2 ei välttämättä toimi vain sitoutumistekijänä, vaan se voi myös auttaa aktivoimaan SARS-CoV-2-piikkiproteiinia kalvofuusiota varten. ACE-2:n roolin parempi ymmärtäminen kalvofuusiossa voi auttaa havainnollistamaan SARS-CoV-2-infektion taustalla olevaa mekanismia ja ennustamaan SARS-CoV-2:n ja muiden vastaavien virusten tulevaa kehitystä.

Tutkimus

Tässä tutkimuksessa tutkijat käyttivät deoksiribonukleiinihappo (DNA)-lipidisidoksia, koska ne voivat siirtyä palautumattomasti kalvoihin ja mahdollistaa ohjelmoitavan itsekokoamisen.

Tämä lähestymistapa mahdollistaa lipideihin konjugoitujen komplementaaristen DNA-juosteiden liittämisen viruspartikkeleihin, jolloin synteettiset liposomit voivat kohdistaa hiukkasiin ilman fysiologisten reseptoreiden tarvetta. Fuusiossa tarvittavat laukaisimet muodostetaan sitten kemiallisesti uudelleen ja testataan. Fuusio havaitaan yhden viruksen optisella mikroskopialla, jossa viruksen tilan muutoksia fuusion aikana seurataan fluoresoivilla väriaineilla. Tutkijat ovat aiemmin käyttäneet DNA-lipidikytkennän lähestymistapaa luonnehtiakseen eri virusperheiden, mukaan lukien flavivirukset ja ortomyksovirukset, pääsyä viruksiin.

Tutkijat käyttivät synteettisiä liposomeja mittaamaan piikkiriippuvaista sitoutumista ja fuusiota synteettisiin ja solukalvoihin varmistaakseen ACE-2-reseptorin puuttumisen. Kokeissa käytettiin kolmea SARS-CoV-2-piikkiä - D614G/N501Y, Wuhan ja Omicron (B.1.1.529) - ja kahta viruspartikkelityyppiä - viruksen kaltaisia ​​partikkeleita (VLP), jotka tuotettiin ekspressoimalla S-, M-, E- ja N-proteiinien pseudoviruksia HIV-ytimessä.

Ryhmä inkuboi erikseen kohdekalvoja ja viruspartikkeleita komplementaaristen DNA-juosteiden kanssa, jotka oli konjugoitu DPPE-lipideihin. Ne immobilisoivat kohdekalvot mikrofluidivirtaussoluun, mikä mahdollisti virushiukkasten sitoutumisen.

Tulokset

Havaittiin, että fuusiotapahtumia tapahtui vain, kun viruspartikkelit sitoutuivat kohdekalvoihin ja proteaasia oli läsnä. Fuusiota seurattiin ensisijaisesti käyttämällä kohdekalvon ja viruspartikkelin välistä lipidiseosta ja se havaittiin sammuttamalla Texas Red -väriaine viruksen kuoressa, mikä johti fluoresenssin vahvistumiseen. DNA-välitteinen viruksen ACE-2-sitoutuminen oli spesifistä; Adsorboituneiden hiukkasten määrä väheni yli 25-kertaiseksi, kun DNA jätettiin pois. Samoin mitään fuusiotapahtumia ei tapahtunut eksogeenisen proteaasin puuttuessa.

Kun verrattiin HIV-ytimille pseudotyyppisten Omicron- ja Wuhan-piikkien virusfuusiokinetiikkaa ja tässä tutkimuksessa käytettyjä Wuhan D614G/N501Y VLP:itä, ryhmä havaitsi, että vaikka molemmilla pseudoviruksilla oli samanlaiset fuusionopeudet, VLP:t antoivat hieman mutta merkittävästi nopeammat fuusionopeudet.

Havaittu ero fuusionopeuksissa voi johtua useista tekijöistä, mukaan lukien vaihtelut piikkiproteiinitiheydessä VLP:issä verrattuna HIV:n ytimeen, E- ja M-proteiineja VLP:issä, D614G/N501Y-mutaatioita ja aktiivisten piikkien prosenttiosuutta VLP:n pinnalla.

Kun aktivointiin käytettyä proteaasia vaihdeltiin Omicron- ja Wuhan-kokeissa, fuusionopeudet eivät olleet herkkiä proteaasipitoisuudelle alueella 200 - 1000 ug/ml. Aiempien raporttien mukaisesti transmembraaninen proteaasi seriini 2 (TMPRSS2) ei ollut tehokas aktivoimaan omikronipiikkejä kalvofuusiota varten. Kuitenkin D614G/N501Y-hiukkasten tapauksessa 40 µg/ml TMPRSS2:n lisääminen johti erilaiseen fuusiokinetiikkaan kuin 200 µg/ml trypsiiniä.

Nämä havainnot viittaavat siihen, että proteolyyttinen pilkkominen ei ehkä ole nopeutta rajoittava vaihe DNA:han sitoutuneiden VLP:iden membraanifuusion kannalta, koska proteaasipitoisuuden muutoksen pitäisi vaikuttaa entsyymi-substraattikompleksin muodostumiseen ja proteaasi-identiteetin muutosten pitäisi muuttaa fuusiokinetiikkaa.

Kun liukoista ACE-2:ta lisättiin samanaikaisesti proteaasiin, havaittiin merkittävä lipidisekoittumiskinetiikan nousu Wuhan- ja Omicron-piikkikokeissa. Tämä osoittaa, että vaikka kalvofuusiota varten tarvittavat piikkiproteiinikonformaatiot ovat saatavilla ilman ACE-2:ta, ACE-2-reseptori edistää piikkikonformaatioita, jotka suosivat kalvofuusiota.

Diplomi

Kaiken kaikkiaan tutkijat havaitsivat, että SARS-CoV-2-pseudovirukset ja VLP:t eivät vaadi ACE-2:ta kalvofuusioon, kun ne aktivoidaan sopivalla proteaasilla. Liukoisen ACE-2:n lisääminen kuitenkin kiihdytti fuusioreaktiota Wuhan SARS-CoV-2 -kannassa ja Omicron-variantissa. Kineettisen analyysin tulokset paljastivat, että viruskalvofuusiossa on vähintään kaksi nopeutta rajoittavaa vaihetta. Toinen vaiheista oli ACE-2-riippuvainen, toinen ei.

Yllä olevat tulokset vahvistavat, että ACE-2-reseptoria ei tarvita biokemiallisesti SARS-CoV-2-kalvofuusiossa, kun vaihtoehtoinen sitoutumistekijä on läsnä. Koska ACE-2 kuitenkin toimii korkean affiniteetin tekijänä viruksen kiinnittymiselle ihmissoluihin, sen korvaaminen muilla kiinnittymistekijöillä voi vaikuttaa SARS-CoV-2:n kehittyvuuteen ja viruksen kuntoympäristöön tulevia uusia koronaviruksia varten.

*Tärkeä HUOMAUTUS:bioRxiv julkaisee alustavia tieteellisiä raportteja, joita ei ole vertaisarvioitu ja joita ei siksi pitäisi pitää vakuuttavina, jotka on tarkoitettu ohjaamaan kliinistä käytäntöä/terveyteen liittyvää käyttäytymistä tai joita ei pitäisi käsitellä vakiintuneina tietoina.

Viite:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Cervantes, M. et al. (2022) „Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber biochemisch nicht für die SARS-CoV-2-Membranfusion erforderlich.“ bioRxiv. doi: 10.1101/2022.10.22.513347. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.22.513347v1