Studija pokazuje da ACE-2 nije biokemijski potreban za fuziju membrane SARS-CoV2

Studija pokazuje da ACE-2 nije biokemijski potreban za fuziju membrane SARS-CoV2

Studija objavljena u bioRxiv * Poslužitelji preprinta testirali su hipotezu da receptor angiotenzin-konvertirajućeg enzima-2 (ACE-2) teškog akutnog respiratornog sindroma koronavirus 2 (SARS-CoV-2) nije samo faktor pričvršćivanja kod virusnih infekcija, već također igra ulogu u aktiviranju proteina virusnog šiljka kako bi se olakšala fuzija membrane.

Studie: Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber für die SARS-CoV-2-Membranfusion biochemisch nicht erforderlich. Bildquelle: Kateryna Kon/Shutterstock

*Važna NAPOMENA:bioRxiv objavljuje preliminarna znanstvena izvješća koja nisu recenzirana i stoga se ne bi trebala smatrati uvjerljivima, namijenjena usmjeravanju kliničke prakse/ponašanja u vezi sa zdravljem, niti ih treba tretirati kao utvrđenu informaciju.

pozadina

Virus SARS-CoV-2 inficira ljudske stanice pomoću ACE-2 receptora domaćina. Protein virusnog šiljka kontrolira ulazak SARS-CoV-2 i infekciju tako što se veže za ACE-2 receptore na površini ljudske stanice. ACE-2 se aktivira proteolitičkim cijepanjem i pokreće fuziju između stanične membrane i virusne ovojnice.

Dokazi iz studija upućuju na to da ACE-2 ne može služiti samo kao faktor vezivanja, već također može pomoći u aktiviranju šiljastog proteina SARS-CoV-2 za fuziju membrane. Bolje razumijevanje uloge ACE-2 u spajanju membrane može pomoći u ilustriranju mehanizma iza infekcije SARS-CoV-2 i predviđanju buduće evolucije SARS-CoV-2 i drugih sličnih virusa.

Studija

U ovoj studiji istraživači su koristili veze deoksiribonukleinske kiseline (DNK) i lipida jer se one mogu nepovratno umetnuti u membrane i omogućiti programabilno samosastavljanje.

Ovaj pristup omogućuje umetanje komplementarnih DNA lanaca konjugiranih na lipide u virusne čestice, dopuštajući sintetskim liposomima da ciljaju čestice bez potrebe za fiziološkim receptorima. Okidači potrebni za fuziju se zatim kemijski rekonstituiraju i testiraju. Fuzija se otkriva pomoću optičke mikroskopije s jednim virusom, gdje se promjene u stanju virusa tijekom fuzije prate pomoću fluorescentnih boja. Istraživači su prethodno koristili pristup vezivanja DNA-lipida za karakterizaciju ulaska virusa u različite obitelji virusa, uključujući flaviviruse i ortomiksoviruse.

Istraživači su koristili sintetičke liposome za mjerenje vezanja i spajanja ovisno o šiljcima na sintetičke i stanične membrane kako bi osigurali odsutnost ACE-2 receptora. U eksperimentima su korištena tri šiljka SARS-CoV-2 - D614G/N501Y, Wuhan i Omicron (B.1.1.529) - i dva tipa virusnih čestica - čestice slične virusu (VLP) proizvedene ekspresijom pseudovirusa S, M, E i N proteina na HIV jezgri.

Tim je odvojeno inkubirao ciljne membrane i virusne čestice s komplementarnim DNA lancima konjugiranim na DPPE lipide. Oni su imobilizirali ciljne membrane u mikrofluidnoj protočnoj ćeliji, čime su omogućili da se virusne čestice vežu.

Rezultati

Utvrđeno je da su se događaji fuzije dogodili samo kada su čestice virusa bile vezane za ciljne membrane i kada je bila prisutna proteaza. Fuzija je praćena prvenstveno uporabom smjese lipida između ciljne membrane i čestice virusa i otkrivena je gašenjem Texas Red boje u ovojnici virusa, što je rezultiralo pojačanjem fluorescencije. Vezanje virusnog ACE-2 posredovano DNA bilo je specifično; Broj adsorbiranih čestica smanjio se više od 25 puta kada je izostavljena DNK. Isto tako, nije došlo do događaja fuzije u odsutnosti egzogene proteaze.

Uspoređujući kinetiku virusne fuzije Omicron i Wuhan šiljaka pseudotipiziranih na HIV jezgrama i Wuhan D614G/N501Y VLP-ova korištenih u ovoj studiji, tim je otkrio da iako su oba pseudovirusa imala slične stope fuzije, VLP-ovi daju malo, ali značajno brže stope fuzije.

Uočena razlika u stopama fuzije mogla bi biti posljedica niza čimbenika, uključujući varijacije u gustoći šiljastih proteina na VLP-ovima u usporedbi s HIV jezgrom, E i M proteinima u VLP-ovima, mutacijama D614G/N501Y i aktivnom postotku šiljastih šiljaka na površini VLP-a.

Kada se proteaza korištena za aktivaciju mijenjala u eksperimentima Omicron i Wuhan, brzine fuzije nisu bile osjetljive na koncentraciju proteaze u rasponu od 200 do 1000 µg/ml. U skladu s prethodnim izvješćima, transmembranska proteaza serin 2 (TMPRSS2) nije bila učinkovita u aktiviranju omikronskih šiljaka za fuziju membrane. Međutim, u slučaju čestica D614G/N501Y, dodavanje 40 μg/mL TMPRSS2 rezultiralo je drugačijom kinetikom fuzije od 200 μg/mL tripsina.

Ova opažanja sugeriraju da proteolitičko cijepanje možda nije korak koji ograničava brzinu membranske fuzije VLP-ova vezanih na DNA jer bi promjena u koncentraciji proteaze trebala utjecati na formiranje kompleksa enzim-supstrat, a promjene u identitetu proteaze trebale bi promijeniti kinetiku fuzije.

Kada je proteazi istovremeno dodan topljivi ACE-2, primijećeno je značajno povećanje stope kinetike miješanja lipida u Wuhan i Omicron spike eksperimentima. Ovo pokazuje da iako su konformacije šiljastih proteina potrebne za fuziju membrane dostupne bez ACE-2, ACE-2 receptor potiče konformacije šiljastih proteina koje pogoduju fuziji membrane.

Diploma

Sve u svemu, istraživači su otkrili da pseudovirusi i VLP-ovi SARS-CoV-2 ne zahtijevaju ACE-2 za fuziju membrane kada se aktiviraju odgovarajućom proteazom. Međutim, dodavanje topljivog ACE-2 ubrzalo je fuzijsku reakciju u soju Wuhan SARS-CoV-2 i varijanti Omicron. Rezultati kinetičke analize otkrili su da postoje najmanje dva koraka koji ograničavaju brzinu spajanja virusne membrane. Jedan od koraka bio je ovisan o ACE-2, drugi nije.

Gore navedeni rezultati potvrđuju da ACE-2 receptor nije biokemijski potreban za fuziju membrane SARS-CoV-2 kada je prisutan alternativni faktor vezivanja. Međutim, budući da ACE-2 funkcionira kao faktor visokog afiniteta za vezivanje virusa na ljudske stanice, njegova zamjena drugim faktorima vezivanja može utjecati na razvoj SARS-CoV-2 i okolinu prikladnosti virusa za buduće nastajanje koronavirusa.

*Važna NAPOMENA:bioRxiv objavljuje preliminarna znanstvena izvješća koja nisu recenzirana i stoga se ne bi trebala smatrati uvjerljivima, namijenjena usmjeravanju kliničke prakse/ponašanja u vezi sa zdravljem, niti ih treba tretirati kao utvrđenu informaciju.

Referenca:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Cervantes, M. et al. (2022) „Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber biochemisch nicht für die SARS-CoV-2-Membranfusion erforderlich.“ bioRxiv. doi: 10.1101/2022.10.22.513347. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.22.513347v1