Tyrimas rodo, kad ACE-2 nėra biochemiškai reikalingas SARS-CoV2 membranos suliejimui

Tyrimas rodo, kad ACE-2 nėra biochemiškai reikalingas SARS-CoV2 membranos suliejimui

Tyrimas, paskelbtas m bioRxiv * Išankstinio spausdinimo serveriai patikrino hipotezę, kad sunkaus ūminio kvėpavimo sindromo koronaviruso 2 (SARS-CoV-2) angiotenziną konvertuojančio fermento-2 (AKF-2) receptorius yra ne tik virusinių infekcijų surišimo veiksnys, bet ir vaidina svarbų vaidmenį aktyvuojant viruso smaigalio baltymą, kad palengvintų membranos susiliejimą.

Studie: Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber für die SARS-CoV-2-Membranfusion biochemisch nicht erforderlich. Bildquelle: Kateryna Kon/Shutterstock

*Svarbi PASTABA:BioRxiv skelbia preliminarias mokslines ataskaitas, kurios nėra recenzuojamos, todėl neturėtų būti laikomos įtikinamais, skirtos vadovautis klinikine praktika / su sveikata susijusiu elgesiu arba laikomos nustatyta informacija.

fone

SARS-CoV-2 virusas užkrečia žmogaus ląsteles naudodamas šeimininko AKF-2 receptorių. Virusinio smaigalio baltymas kontroliuoja SARS-CoV-2 patekimą ir infekciją, prisijungdamas prie AKF-2 receptorių žmogaus ląstelės paviršiuje. ACE-2 aktyvuojamas proteolitiniu skilimu ir skatina ląstelės membranos ir viruso apvalkalo susiliejimą.

Tyrimų duomenys rodo, kad ACE-2 gali būti ne tik surišimo faktorius, bet ir padėti suaktyvinti SARS-CoV-2 smaigalio baltymą membranos suliejimui. Geresnis ACE-2 vaidmens membranų sintezėje supratimas gali padėti iliustruoti SARS-CoV-2 infekcijos mechanizmą ir numatyti būsimą SARS-CoV-2 ir kitų panašių virusų evoliuciją.

Studija

Šiame tyrime mokslininkai naudojo dezoksiribonukleino rūgšties (DNR) ir lipidų ryšius, nes jie gali negrįžtamai įterpti į membranas ir įgalinti programuojamą savaiminį surinkimą.

Šis metodas leidžia į viruso daleles įterpti papildomas DNR grandines, konjuguotas su lipidais, o tai leidžia sintetinėms liposomoms nukreipti daleles be fiziologinių receptorių. Tada sintezei reikalingi trigeriai yra chemiškai atkuriami ir išbandomi. Susiliejimas aptinkamas naudojant vieno viruso optinę mikroskopiją, kai viruso būsenos pokyčiai sintezės metu stebimi naudojant fluorescencinius dažus. Tyrėjai anksčiau naudojo DNR ir lipidų pririšimo metodą, kad apibūdintų virusų patekimą į įvairias virusų šeimas, įskaitant flavivirusus ir ortomiksovirusus.

Tyrėjai naudojo sintetines liposomas, kad išmatuotų nuo smaigalių priklausomą surišimą ir susiliejimą su sintetinėmis ir ląstelių membranomis, kad užtikrintų AKF-2 receptoriaus nebuvimą. Eksperimentuose buvo naudojami trys SARS-CoV-2 spygliai – D614G/N501Y, Wuhan ir Omicron (B.1.1.529) – ir du virusinių dalelių tipai – į virusus panašios dalelės (VLP), gaminamos ekspresuojant S, M, E ir N baltymų pseudovirusus ŽIV šerdyje.

Komanda atskirai inkubavo tikslines membranas ir viruso daleles su papildomomis DNR grandinėmis, konjuguotomis su DPPE lipidais. Jie imobilizavo tikslines membranas mikrofluidinio srauto ląstelėje, taip leisdami viruso dalelėms prisijungti.

Rezultatai

Nustatyta, kad susiliejimo įvykiai įvyko tik tada, kai viruso dalelės buvo prijungtos prie tikslinių membranų ir buvo proteazė. Susiliejimas buvo stebimas visų pirma naudojant lipidų mišinį tarp tikslinės membranos ir viruso dalelės ir buvo aptiktas užgesinant Texas Red dažą viruso apvalkale, todėl pagerėjo fluorescencija. DNR sukeltas viruso AKF-2 prisijungimas buvo specifinis; Atsisakius DNR, adsorbuotų dalelių skaičius sumažėjo daugiau nei 25 kartus. Panašiai, nesant egzogeninės proteazės, sintezės įvykių neįvyko.

Lygindama Omicron ir Wuhan spyglių virusų susiliejimo kinetiką su pseudotipais ant ŽIV branduolių ir Wuhan D614G/N501Y VLP, naudotų šiame tyrime, komanda nustatė, kad nors abiejų pseudovirusų susiliejimo greitis buvo panašus, VLP davė šiek tiek, bet žymiai greitesnį susiliejimo greitį.

Stebėtą sintezės greičio skirtumą gali lemti įvairūs veiksniai, įskaitant smailių baltymų tankio skirtumus VLP, palyginti su ŽIV šerdimi, E ir M baltymus VLP, D614G/N501Y mutacijas ir aktyvų smaigalio procentą VLP paviršiuje.

Kai Omicron ir Wuhan eksperimentuose aktyvacijai naudojama proteazė buvo keičiama, sintezės greitis nebuvo jautrus proteazės koncentracijai nuo 200 iki 1000 µg/ml. Remiantis ankstesnėmis ataskaitomis, transmembraninė proteazė serinas 2 (TMPRSS2) nebuvo veiksmingas aktyvuojant omikroninius spyglius membranų suliejimui. Tačiau D614G/N501Y dalelių atveju, pridėjus 40 μg/mL TMPRSS2, susiliejimo kinetika buvo kitokia nei 200 μg/mL tripsino.

Šie stebėjimai rodo, kad proteolitinis skilimas gali būti ne DNR surištų VLP membranos suliejimo greitį ribojantis žingsnis, nes proteazės koncentracijos pokytis turėtų turėti įtakos fermento ir substrato komplekso susidarymui, o proteazės tapatumo pokyčiai turėtų pakeisti sintezės kinetiką.

Kai į proteazę vienu metu buvo pridėta tirpaus ACE-2, Wuhan ir Omicron smaigalių eksperimentuose buvo pastebėtas reikšmingas lipidų maišymosi kinetikos greičio padidėjimas. Tai rodo, kad nors membranos suliejimui reikalingos smailių baltymų konformacijos yra prieinamos be AKF-2, ACE-2 receptorius skatina smaigalio konformacijas, kurios skatina membranų susiliejimą.

Diplomas

Apskritai mokslininkai nustatė, kad SARS-CoV-2 pseudovirusams ir VLP nereikia ACE-2 membranų suliejimui, kai jie aktyvuojami atitinkama proteaze. Tačiau tirpaus ACE-2 pridėjimas pagreitino sintezės reakciją Wuhan SARS-CoV-2 padermėje ir Omicron variante. Kinetinės analizės rezultatai atskleidė, kad viruso membranos susiliejimui yra bent du greitį ribojantys žingsniai. Vienas iš žingsnių priklausė nuo ACE-2, kitas – ne.

Aukščiau pateikti rezultatai patvirtina, kad AKF receptorius nėra biochemiškai reikalingas SARS-CoV-2 membranos suliejimui, kai yra alternatyvus surišimo faktorius. Tačiau kadangi ACE-2 veikia kaip didelio afiniteto faktorius virusui prisijungti prie žmogaus ląstelių, jo pakeitimas kitais prisirišimo veiksniais gali turėti įtakos SARS-CoV-2 vystymuisi ir viruso tinkamumo aplinkai būsimiems besikuriantiems koronavirusams.

*Svarbi PASTABA:BioRxiv skelbia preliminarias mokslines ataskaitas, kurios nėra recenzuojamos, todėl neturėtų būti laikomos įtikinamais, skirtos vadovautis klinikine praktika / su sveikata susijusiu elgesiu arba laikomos nustatyta informacija.

Nuoroda:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Cervantes, M. et al. (2022) „Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber biochemisch nicht für die SARS-CoV-2-Membranfusion erforderlich.“ bioRxiv. doi: 10.1101/2022.10.22.513347. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.22.513347v1