Onderzoek toont aan dat ACE-2 biochemisch niet vereist is voor SARS-CoV2-membraanfusie

Onderzoek toont aan dat ACE-2 biochemisch niet vereist is voor SARS-CoV2-membraanfusie

Een studie gepubliceerd in bioRxiv * Preprint-servers testten de hypothese dat de angiotensine-converting enzyme-2 (ACE-2)-receptor van het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) niet alleen een hechtingsfactor is bij virale infecties, maar ook een rol speelt bij het activeren van viraal spike-eiwit om membraanfusie te vergemakkelijken.

Studie: Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber für die SARS-CoV-2-Membranfusion biochemisch nicht erforderlich. Bildquelle: Kateryna Kon/Shutterstock

*Belangrijke OPMERKING:bioRxiv publiceert voorlopige wetenschappelijke rapporten die niet door vakgenoten zijn beoordeeld en daarom niet als overtuigend mogen worden beschouwd, niet bedoeld zijn als leidraad voor de klinische praktijk/gezondheidsgerelateerd gedrag, of moeten worden behandeld als gevestigde informatie.

achtergrond

Het SARS-CoV-2-virus infecteert menselijke cellen met behulp van de ACE-2-receptor van de gastheer. Het virale spike-eiwit controleert het binnendringen en de infectie van SARS-CoV-2 door zich te binden aan de ACE-2-receptoren op het oppervlak van de menselijke cel. ACE-2 wordt geactiveerd door proteolytische splitsing en stimuleert de fusie tussen het celmembraan en de virale envelop.

Uit onderzoek blijkt dat ACE-2 niet alleen als bindende factor kan dienen, maar ook kan helpen bij het activeren van het SARS-CoV-2-spike-eiwit voor membraanfusie. Een beter begrip van de rol van ACE-2 bij membraanfusie kan het mechanisme achter SARS-CoV-2-infectie helpen illustreren en de toekomstige evolutie van SARS-CoV-2 en andere soortgelijke virussen voorspellen.

De studie

In de huidige studie gebruikten onderzoekers deoxyribonucleïnezuur (DNA)-lipidebindingen omdat ze onomkeerbaar in membranen kunnen worden ingebracht en programmeerbare zelfassemblage mogelijk maken.

Deze aanpak maakt het mogelijk dat complementaire DNA-strengen die aan lipiden zijn geconjugeerd, in virale deeltjes worden ingebracht, waardoor synthetische liposomen zich op de deeltjes kunnen richten zonder de noodzaak van fysiologische receptoren. De triggers die nodig zijn voor fusie worden vervolgens chemisch gereconstitueerd en getest. Fusie wordt gedetecteerd met behulp van optische microscopie met één virus, waarbij veranderingen in de virusstatus tijdens fusie worden gevolgd met behulp van fluorescerende kleurstoffen. Onderzoekers hebben eerder de DNA-lipide-tethering-aanpak gebruikt om de virale binnenkomst van verschillende virusfamilies te karakteriseren, waaronder flavivirussen en orthomyxovirussen.

De onderzoekers gebruikten synthetische liposomen om de piekafhankelijke binding en fusie aan synthetische en celmembranen te meten om de afwezigheid van de ACE-2-receptor te garanderen. Bij de experimenten werden drie SARS-CoV-2-spikes gebruikt – D614G/N501Y, Wuhan en Omicron (B.1.1.529) – en twee typen virale deeltjes – virusachtige deeltjes (VLP’s) geproduceerd door de expressie van S-, M-, E- en N-eiwitten, pseudovirussen op een HIV-kern.

Het team incubeerde afzonderlijk doelmembranen en virusdeeltjes met complementaire DNA-strengen geconjugeerd aan DPPE-lipiden. Ze immobiliseerden doelmembranen in een microfluïdische stroomcel, waardoor de virusdeeltjes zich konden binden.

Resultaten

Er werd gevonden dat fusiegebeurtenissen alleen plaatsvonden wanneer virusdeeltjes aan doelmembranen waren gebonden en protease aanwezig was. Fusie werd voornamelijk gevolgd met behulp van het lipidemengsel tussen het doelmembraan en het virusdeeltje en werd gedetecteerd door de Texas Red-kleurstof in de virusenvelop uit te doven, wat resulteerde in fluorescentieverbetering. DNA-gemedieerde virale ACE-2-binding was specifiek; Het aantal geadsorbeerde deeltjes nam meer dan 25 keer af als DNA werd weggelaten. Op soortgelijke wijze vonden er geen fusiegebeurtenissen plaats in de afwezigheid van exogeen protease.

Bij het vergelijken van de virale fusiekinetiek van de Omicron- en Wuhan-spikes, gepseudotypeerd op HIV-kernen, en de Wuhan D614G/N501Y VLP's die in deze studie werden gebruikt, ontdekte het team dat hoewel beide pseudovirussen vergelijkbare fusiesnelheden hadden, de VLP's iets maar significant snellere fusiesnelheden opleverden.

Het waargenomen verschil in fusiesnelheden kan te wijten zijn aan een verscheidenheid aan factoren, waaronder variaties in de dichtheid van piekeiwitten op de VLP's in vergelijking met de HIV-kern, E- en M-eiwitten in de VLP's, de D614G/N501Y-mutaties en het actieve piekpercentage op het VLP-oppervlak.

Toen het voor activering gebruikte protease werd gevarieerd in de experimenten van Omicron en Wuhan, waren de fusiesnelheden niet gevoelig voor proteaseconcentraties in het bereik van 200 tot 1000 µg/ml. In overeenstemming met eerdere rapporten was het transmembraanprotease serine 2 (TMPRSS2) niet efficiënt in het activeren van omicron-spikes voor membraanfusie. In het geval van D614G/N501Y-deeltjes resulteerde de toevoeging van 40 μg/ml TMPRSS2 echter in een andere fusiekinetiek dan 200 μg/ml trypsine.

Deze waarnemingen suggereren dat proteolytische splitsing mogelijk niet de snelheidsbeperkende stap is voor membraanfusie van DNA-gebonden VLP's, omdat een verandering in proteaseconcentratie de vorming van het enzym-substraatcomplex zou moeten beïnvloeden en veranderingen in protease-identiteit de fusiekinetiek zouden moeten veranderen.

Wanneer oplosbaar ACE-2 gelijktijdig aan het protease werd toegevoegd, werd een significante toename in de snelheid van de lipidenmengkinetiek waargenomen in de piekexperimenten van Wuhan en Omicron. Dit toont aan dat hoewel de voor membraanfusie vereiste spike-eiwitconformaties toegankelijk zijn zonder ACE-2, de ACE-2-receptor spike-conformaties bevordert die membraanfusie bevorderen.

Diploma

Over het geheel genomen ontdekten de onderzoekers dat SARS-CoV-2-pseudovirussen en VLP’s geen ACE-2 nodig hebben voor membraanfusie wanneer ze worden geactiveerd met een geschikt protease. De toevoeging van oplosbaar ACE-2 versnelde echter de fusiereactie in de Wuhan SARS-CoV-2-stam en de Omicron-variant. De resultaten van de kinetische analyse onthulden dat er ten minste twee snelheidsbeperkende stappen zijn voor virale membraanfusie. Eén van de stappen was ACE-2-afhankelijk, de andere niet.

De bovenstaande resultaten bevestigen dat de ACE-2-receptor biochemisch niet vereist is voor SARS-CoV-2-membraanfusie als er een alternatieve bindingsfactor aanwezig is. Omdat ACE-2 echter functioneert als een factor met hoge affiniteit voor de hechting van virussen aan menselijke cellen, kan de vervanging ervan door andere hechtingsfactoren de evolueerbaarheid van SARS-CoV-2 en de virale fitnessomgeving voor toekomstige opkomende coronavirussen beïnvloeden.

*Belangrijke OPMERKING:bioRxiv publiceert voorlopige wetenschappelijke rapporten die niet door vakgenoten zijn beoordeeld en daarom niet als overtuigend mogen worden beschouwd, niet bedoeld zijn als leidraad voor de klinische praktijk/gezondheidsgerelateerd gedrag, of moeten worden behandeld als gevestigde informatie.

Referentie:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Cervantes, M. et al. (2022) „Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber biochemisch nicht für die SARS-CoV-2-Membranfusion erforderlich.“ bioRxiv. doi: 10.1101/2022.10.22.513347. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.22.513347v1