Estudo mostra que o ACE-2 não é bioquimicamente necessário para a fusão da membrana SARS-CoV2

Estudo mostra que o ACE-2 não é bioquimicamente necessário para a fusão da membrana SARS-CoV2

Um estudo publicado em bioRxiv * Os servidores de pré-impressão testaram a hipótese de que o receptor da enzima conversora de angiotensina 2 (ACE-2) do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) não é apenas um fator de ligação em infecções virais, mas também desempenha um papel na ativação da proteína spike viral para facilitar a fusão da membrana.

Studie: Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber für die SARS-CoV-2-Membranfusion biochemisch nicht erforderlich. Bildquelle: Kateryna Kon/Shutterstock

*NOTA IMPORTANTE:O bioRxiv publica relatórios científicos preliminares que não são revisados ​​por pares e, portanto, não devem ser considerados conclusivos, destinados a orientar a prática clínica/comportamento relacionado à saúde, ou tratados como informações estabelecidas.

fundo

O vírus SARS-CoV-2 infecta células humanas usando o receptor ACE-2 do hospedeiro. A proteína viral spike controla a entrada e a infecção do SARS-CoV-2 ligando-se aos receptores ACE-2 na superfície da célula humana. A ACE-2 é ativada por clivagem proteolítica e impulsiona a fusão entre a membrana celular e o envelope viral.

As evidências de estudos sugerem que o ACE-2 pode não apenas servir como um fator de ligação, mas também ajudar a ativar a proteína spike do SARS-CoV-2 para a fusão da membrana. Uma melhor compreensão do papel da ACE-2 na fusão da membrana pode ajudar a ilustrar o mecanismo por trás da infecção por SARS-CoV-2 e prever a evolução futura do SARS-CoV-2 e de outros vírus semelhantes.

O estudo

No presente estudo, os pesquisadores usaram ligações lipídicas de ácido desoxirribonucléico (DNA) porque podem ser inseridas irreversivelmente nas membranas e permitir a automontagem programável.

Esta abordagem permite que cadeias complementares de ADN conjugadas com lípidos sejam inseridas em partículas virais, permitindo que lipossomas sintéticos atinjam as partículas sem a necessidade de receptores fisiológicos. Os gatilhos necessários para a fusão são então reconstituídos quimicamente e testados. A fusão é detectada usando microscopia óptica de vírus único, onde as mudanças no estado do vírus durante a fusão são monitoradas usando corantes fluorescentes. Os pesquisadores já usaram a abordagem de ligação DNA-lipídio para caracterizar a entrada viral de várias famílias de vírus, incluindo flavivírus e ortomixovírus.

Os pesquisadores usaram lipossomas sintéticos para medir a ligação e fusão dependente de picos às membranas sintéticas e celulares para garantir a ausência do receptor ACE-2. Três picos de SARS-CoV-2 - D614G/N501Y, Wuhan e Omicron (B.1.1.529) - e dois tipos de partículas virais - partículas semelhantes a vírus (VLPs) produzidas pela expressão de pseudovírus das proteínas S, M, E e N em um núcleo de HIV - foram usados ​​nos experimentos.

A equipe incubou separadamente membranas-alvo e partículas virais com fitas complementares de DNA conjugadas com lipídios DPPE. Eles imobilizaram membranas alvo em uma célula de fluxo microfluídico, permitindo assim que as partículas virais se ligassem.

Resultados

Verificou-se que os eventos de fusão só ocorreram quando as partículas virais estavam ligadas às membranas alvo e a protease estava presente. A fusão foi monitorada principalmente usando a mistura lipídica entre a membrana alvo e a partícula do vírus e foi detectada pela extinção do corante Texas Red no envelope do vírus, resultando em aumento de fluorescência. A ligação viral de ACE-2 mediada por DNA foi específica; O número de partículas adsorvidas diminuiu mais de 25 vezes quando o DNA foi omitido. Da mesma forma, não ocorreram eventos de fusão na ausência de protease exógena.

Ao comparar a cinética de fusão viral dos picos Omicron e Wuhan pseudotipados em núcleos de HIV e as VLPs Wuhan D614G/N501Y usadas neste estudo, a equipe descobriu que, embora ambos os pseudovírus tivessem taxas de fusão semelhantes, as VLPs proporcionaram taxas de fusão ligeiramente, mas significativamente mais rápidas.

A diferença observada nas taxas de fusão pode ser devida a uma variedade de fatores, incluindo variações na densidade da proteína spike nas VLPs em comparação com o núcleo do HIV, proteínas E e M nas VLPs, as mutações D614G/N501Y e a porcentagem de pico ativo na superfície da VLP.

Quando a protease utilizada para activação foi variada nas experiências de Omicron e Wuhan, as taxas de fusão não foram sensíveis à concentração de protease na gama de 200 a 1000 µg/ml. Consistente com relatos anteriores, a protease transmembrana serina 2 (TMPRSS2) não foi eficiente na ativação de picos de omícrons para fusão de membranas. No entanto, no caso das partículas D614G/N501Y, a adição de 40 μg/mL de TMPRSS2 resultou em cinética de fusão diferente de 200 μg/mL de tripsina.

Estas observações sugerem que a clivagem proteolítica pode não ser o passo limitante da taxa de fusão da membrana de VLPs ligadas ao ADN porque uma alteração na concentração de protease deve influenciar a formação do complexo enzima-substrato e as alterações na identidade da protease devem alterar a cinética de fusão.

Quando o ACE-2 solúvel foi adicionado simultaneamente à protease, um aumento significativo na taxa de cinética de mistura lipídica foi observado em experimentos de pico de Wuhan e Omicron. Isto mostra que embora as conformações da proteína spike necessárias para a fusão da membrana sejam acessíveis sem ACE-2, o receptor ACE-2 promove conformações de espícula que favorecem a fusão da membrana.

Diploma

No geral, os pesquisadores descobriram que os pseudovírus e VLPs do SARS-CoV-2 não requerem ACE-2 para a fusão da membrana quando ativados com uma protease apropriada. Contudo, a adição de ACE-2 solúvel acelerou a reação de fusão na cepa Wuhan SARS-CoV-2 e na variante Omicron. Os resultados da análise cinética revelaram que existem pelo menos duas etapas limitantes da taxa de fusão da membrana viral. Uma das etapas era dependente de ACE-2, a outra não.

Os resultados acima confirmam que o receptor ACE-2 não é bioquimicamente necessário para a fusão da membrana SARS-CoV-2 quando um factor de ligação alternativo está presente. No entanto, uma vez que o ACE-2 funciona como um factor de alta afinidade para a ligação do vírus às células humanas, a sua substituição por outros factores de ligação pode afectar a capacidade de evolução do SARS-CoV-2 e o ambiente de aptidão viral para futuros coronavírus emergentes.

*NOTA IMPORTANTE:O bioRxiv publica relatórios científicos preliminares que não são revisados ​​por pares e, portanto, não devem ser considerados conclusivos, destinados a orientar a prática clínica/comportamento relacionado à saúde, ou tratados como informações estabelecidas.

Referência:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Cervantes, M. et al. (2022) „Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber biochemisch nicht für die SARS-CoV-2-Membranfusion erforderlich.“ bioRxiv. doi: 10.1101/2022.10.22.513347. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.22.513347v1