Studiul arată că ACE-2 nu este necesar din punct de vedere biochimic pentru fuziunea membranei SARS-CoV2

Studiul arată că ACE-2 nu este necesar din punct de vedere biochimic pentru fuziunea membranei SARS-CoV2

Un studiu publicat în bioRxiv * Serverele de preprint au testat ipoteza conform căreia receptorul enzimei de conversie a angiotensinei-2 (ACE-2) al sindromului respirator acut sever coronavirus 2 (SARS-CoV-2) nu este doar un factor de legare în infecțiile virale, ci joacă, de asemenea, un rol în activarea proteinei spike virale pentru a facilita fuziunea membranei.

Studie: Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber für die SARS-CoV-2-Membranfusion biochemisch nicht erforderlich. Bildquelle: Kateryna Kon/Shutterstock

*NOTA importanta:bioRxiv publică rapoarte științifice preliminare care nu sunt revizuite de către colegi și, prin urmare, nu trebuie considerate concludente, menite să ghideze practica clinică/comportamentul legat de sănătate sau tratate ca informații stabilite.

fundal

Virusul SARS-CoV-2 infectează celulele umane folosind receptorul ACE-2 al gazdei. Proteina virală spike controlează intrarea și infecția cu SARS-CoV-2 prin legarea de receptorii ACE-2 de pe suprafața celulei umane. ACE-2 este activat prin clivaj proteolitic și conduce fuziunea dintre membrana celulară și învelișul viral.

Dovezile din studii sugerează că ACE-2 poate servi nu numai ca factor de legare, ci poate ajuta și la activarea proteinei spike SARS-CoV-2 pentru fuziunea membranei. O mai bună înțelegere a rolului ACE-2 în fuziunea membranei poate ajuta la ilustrarea mecanismului din spatele infecției cu SARS-CoV-2 și poate prezice evoluția viitoare a SARS-CoV-2 și a altor virusuri similare.

Studiul

În studiul de față, cercetătorii au folosit legături acid deoxiribonucleic (ADN)-lipidic deoarece se pot introduce ireversibil în membrane și permit auto-asamblarea programabilă.

Această abordare permite ca catenele de ADN complementare conjugate cu lipide să fie inserate în particule virale, permițând lipozomilor sintetici să țintească particulele fără a fi nevoie de receptori fiziologici. Declanșatorii necesari pentru fuziune sunt apoi reconstituiți chimic și testați. Fuziunea este detectată utilizând microscopia optică cu un singur virus, unde modificările stării virusului în timpul fuziunii sunt monitorizate folosind coloranți fluorescenți. Cercetătorii au folosit anterior abordarea ADN-lipide pentru a caracteriza intrarea virală a diferitelor familii de virusuri, inclusiv flavivirusuri și orthomyxoviruses.

Cercetătorii au folosit lipozomi sintetici pentru a măsura legarea dependentă de vârf și fuziunea cu membranele sintetice și celulare pentru a asigura absența receptorului ACE-2. Trei vârfuri SARS-CoV-2 - D614G/N501Y, Wuhan și Omicron (B.1.1.529) - și două tipuri de particule virale - particule asemănătoare virusului (VLP) produse prin exprimarea pseudovirusurilor proteinelor S, M, E și N pe un nucleu HIV - au fost utilizate în experimente.

Echipa a incubat separat membrane țintă și particule de virus cu catene complementare de ADN conjugate cu lipidele DPPE. Ei au imobilizat membranele țintă într-o celulă cu flux microfluidic, permițând astfel particulelor de virus să se lege.

Rezultate

S-a descoperit că evenimentele de fuziune au avut loc numai atunci când particulele de virus au fost legate de membranele țintă și era prezentă protează. Fuziunea a fost monitorizată în principal utilizând amestecul de lipide dintre membrana țintă și particula de virus și a fost detectată prin stingerea colorantului Texas Red din învelișul virusului, rezultând o îmbunătățire a fluorescenței. Legarea ACE-2 virală mediată de ADN a fost specifică; Numărul de particule adsorbite a scăzut de peste 25 de ori atunci când ADN-ul a fost omis. De asemenea, nu au avut loc evenimente de fuziune în absența proteazei exogene.

Când a comparat cinetica de fuziune virală a vârfurilor Omicron și Wuhan pseudotipate pe miezurile HIV și a VLP-urilor Wuhan D614G/N501Y utilizate în acest studiu, echipa a descoperit că, în timp ce ambele pseudovirusuri au avut rate similare de fuziune, VLP-urile au dat rate de fuziune ușor, dar semnificativ mai rapide.

Diferența observată în ratele de fuziune s-ar putea datora unei varietăți de factori, inclusiv variații ale densității proteinei spike pe VLP în comparație cu miezul HIV, proteinele E și M din VLP, mutațiile D614G/N501Y și procentul de vârf activ pe suprafața VLP.

Când proteaza utilizată pentru activare a fost variată în experimentele Omicron și Wuhan, ratele de fuziune nu au fost sensibile la concentrația de protează în intervalul de la 200 la 1000 pg/ml. În conformitate cu rapoartele anterioare, protează serină 2 transmembranară (TMPRSS2) nu a fost eficientă în activarea vârfurilor de omicron pentru fuziunea membranei. Cu toate acestea, în cazul particulelor D614G/N501Y, adăugarea a 40 μg/mL TMPRSS2 a dus la o cinetică de fuziune diferită de 200 μg/mL tripsină.

Aceste observații sugerează că clivajul proteolitic poate să nu fie etapa de limitare a vitezei pentru fuziunea membranară a VLP-urilor legate de ADN, deoarece o modificare a concentrației de protează ar trebui să influențeze formarea complexului enzimă-substrat, iar modificările identității proteazei ar trebui să modifice cinetica fuziunii.

Când ACE-2 solubil a fost adăugat simultan la protează, o creștere semnificativă a vitezei de amestecare a lipidelor a fost observată în experimentele Wuhan și Omicron. Acest lucru arată că, deși conformațiile proteinei spike necesare pentru fuziunea membranei sunt accesibile fără ACE-2, receptorul ACE-2 promovează conformațiile spike care favorizează fuziunea membranei.

Diplomă

În general, cercetătorii au descoperit că pseudovirusurile SARS-CoV-2 și VLP-urile nu necesită ACE-2 pentru fuziunea membranei atunci când sunt activate cu o protează adecvată. Cu toate acestea, adăugarea de ACE-2 solubil a accelerat reacția de fuziune în tulpina Wuhan SARS-CoV-2 și varianta Omicron. Rezultatele analizei cinetice au arătat că există cel puțin doi pași de limitare a vitezei pentru fuziunea membranei virale. Unul dintre pași a fost dependent de ACE-2, celălalt nu.

Rezultatele de mai sus confirmă că receptorul ACE-2 nu este necesar din punct de vedere biochimic pentru fuziunea membranei SARS-CoV-2 atunci când este prezent un factor de legare alternativ. Cu toate acestea, deoarece ACE-2 funcționează ca un factor de mare afinitate pentru atașarea virusului la celulele umane, înlocuirea sa cu alți factori de atașare poate afecta evoluția SARS-CoV-2 și mediul de fitness viral pentru viitoarele coronavirusuri emergente.

*NOTA importanta:bioRxiv publică rapoarte științifice preliminare care nu sunt revizuite de către colegi și, prin urmare, nu trebuie considerate concludente, menite să ghideze practica clinică/comportamentul legat de sănătate sau tratate ca informații stabilite.

Referinţă:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Cervantes, M. et al. (2022) „Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber biochemisch nicht für die SARS-CoV-2-Membranfusion erforderlich.“ bioRxiv. doi: 10.1101/2022.10.22.513347. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.22.513347v1