Štúdia ukazuje, že ACE-2 nie je biochemicky potrebný na membránovú fúziu SARS-CoV2

Štúdia ukazuje, že ACE-2 nie je biochemicky potrebný na membránovú fúziu SARS-CoV2

Štúdia publikovaná v r bioRxiv * Predtlačové servery testovali hypotézu, že receptor angiotenzín-konvertujúceho enzýmu-2 (ACE-2) koronavírusu 2 (SARS-CoV-2) pre závažný akútny respiračný syndróm nie je len pripájacím faktorom pri vírusových infekciách, ale zohráva úlohu aj pri aktivácii vírusového spike proteínu na uľahčenie membránovej fúzie.

Studie: Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber für die SARS-CoV-2-Membranfusion biochemisch nicht erforderlich. Bildquelle: Kateryna Kon/Shutterstock

*Dôležitá POZNÁMKA:bioRxiv publikuje predbežné vedecké správy, ktoré nie sú recenzované odborníkmi, a preto by sa nemali považovať za presvedčivé, určené na usmernenie klinickej praxe/správania súvisiaceho so zdravím, alebo by sa s nimi nemalo zaobchádzať ako s overenými informáciami.

pozadia

Vírus SARS-CoV-2 infikuje ľudské bunky pomocou hostiteľského ACE-2 receptora. Vírusový spike proteín kontroluje vstup a infekciu SARS-CoV-2 väzbou na ACE-2 receptory na povrchu ľudskej bunky. ACE-2 je aktivovaný proteolytickým štiepením a riadi fúziu medzi bunkovou membránou a vírusovým obalom.

Dôkazy zo štúdií naznačujú, že ACE-2 nemusí slúžiť len ako väzbový faktor, ale môže tiež pomôcť aktivovať spike proteín SARS-CoV-2 pre membránovú fúziu. Lepšie pochopenie úlohy ACE-2 v membránovej fúzii môže pomôcť objasniť mechanizmus infekcie SARS-CoV-2 a predpovedať budúci vývoj SARS-CoV-2 a iných podobných vírusov.

Štúdia

V tejto štúdii výskumníci použili väzby deoxyribonukleovej kyseliny (DNA)-lipid, pretože sa môžu nevratne vložiť do membrán a umožniť programovateľné samozostavenie.

Tento prístup umožňuje vloženie komplementárnych reťazcov DNA konjugovaných s lipidmi do vírusových častíc, čo umožňuje syntetickým lipozómom zacieliť častice bez potreby fyziologických receptorov. Spúšťače potrebné na fúziu sa potom chemicky rekonštituujú a testujú. Fúzia sa deteguje pomocou jednovírusovej optickej mikroskopie, kde sa zmeny stavu vírusu počas fúzie monitorujú pomocou fluorescenčných farbív. Výskumníci už predtým použili prístup DNA-lipidového uväzovania na charakterizáciu vírusového vstupu rôznych rodín vírusov, vrátane flavivírusov a ortomyxovírusov.

Výskumníci použili syntetické lipozómy na meranie viazania a fúzie závislej od hrotov na syntetické a bunkové membrány, aby sa zabezpečila absencia receptora ACE-2. V experimentoch boli použité tri hroty SARS-CoV-2 – D614G/N501Y, Wuhan a Omicron (B.1.1.529) – a dva typy vírusových častíc – vírusu podobné častice (VLP) produkované expresiou pseudovírusov proteínov S, M, E a N na jadre HIV.

Tím oddelene inkuboval cieľové membrány a vírusové častice s komplementárnymi vláknami DNA konjugovanými s lipidmi DPPE. Imobilizovali cieľové membrány v mikrofluidnej prietokovej bunke, čím umožnili vírusovým časticiam naviazať sa.

Výsledky

Zistilo sa, že fúzne udalosti sa vyskytli len vtedy, keď boli vírusové častice naviazané na cieľové membrány a bola prítomná proteáza. Fúzia bola monitorovaná primárne s použitím lipidovej zmesi medzi cieľovou membránou a vírusovou časticou a bola detegovaná potlačením farbiva Texas Red vo vírusovom obale, čo viedlo k zvýšeniu fluorescencie. Vírusová väzba ACE-2 sprostredkovaná DNA bola špecifická; Počet adsorbovaných častíc sa znížil viac ako 25-krát, keď sa vynechala DNA. Podobne sa nevyskytli žiadne fúzne udalosti v neprítomnosti exogénnej proteázy.

Pri porovnaní kinetiky vírusovej fúzie hrotov Omicron a Wuhan pseudotypizovaných na jadrách HIV a VLP Wuhan D614G/N501Y použitých v tejto štúdii tím zistil, že zatiaľ čo oba pseudovírusy mali podobné rýchlosti fúzie, VLP poskytli mierne, ale výrazne rýchlejšie rýchlosti fúzie.

Pozorovaný rozdiel v rýchlostiach fúzie by mohol byť spôsobený rôznymi faktormi, vrátane variácií v hustote hrotových proteínov na VLP v porovnaní s jadrom HIV, E a M proteínmi vo VLP, mutáciami D614G/N501Y a percentom aktívnych hrotov na povrchu VLP.

Keď sa proteáza použitá na aktiváciu menila v experimentoch Omicron a Wuhan, rýchlosti fúzie neboli citlivé na koncentráciu proteázy v rozsahu 200 až 1000 ug/ml. V súlade s predchádzajúcimi správami nebola transmembránová proteáza serín 2 (TMPRSS2) účinná pri aktivácii omikrónových hrotov pre membránovú fúziu. Avšak v prípade častíc D614G/N501Y malo pridanie 40 μg/ml TMPRSS2 za následok odlišnú kinetiku fúzie ako 200 μg/ml trypsínu.

Tieto pozorovania naznačujú, že proteolytické štiepenie nemusí byť krokom obmedzujúcim rýchlosť pre membránovú fúziu VLP naviazaných na DNA, pretože zmena koncentrácie proteázy by mala ovplyvniť tvorbu komplexu enzým-substrát a zmeny v identite proteázy by mali zmeniť kinetiku fúzie.

Keď bol rozpustný ACE-2 súčasne pridaný k proteáze, bolo pozorované významné zvýšenie rýchlosti kinetiky miešania lipidov v experimentoch Wuhan a Omicron s hrotmi. To ukazuje, že hoci konformácie vrcholového proteínu potrebné na membránovú fúziu sú dostupné bez ACE-2, receptor ACE-2 podporuje vrcholové konformácie, ktoré uprednostňujú membránovú fúziu.

Diplom

Celkovo výskumníci zistili, že pseudovírusy SARS-CoV-2 a VLP nevyžadujú ACE-2 na membránovú fúziu, keď sú aktivované vhodnou proteázou. Pridanie rozpustného ACE-2 však urýchlilo fúznu reakciu v kmeni Wuhan SARS-CoV-2 a variante Omicron. Výsledky kinetickej analýzy odhalili, že existujú aspoň dva kroky obmedzujúce rýchlosť fúzie vírusovej membrány. Jeden z krokov bol závislý od ACE-2, druhý nie.

Vyššie uvedené výsledky potvrdzujú, že receptor ACE-2 nie je biochemicky potrebný na membránovú fúziu SARS-CoV-2, keď je prítomný alternatívny väzbový faktor. Keďže však ACE-2 funguje ako vysokoafinitný faktor na pripojenie vírusu k ľudským bunkám, jeho nahradenie inými faktormi pripojenia môže ovplyvniť vývoj SARS-CoV-2 a prostredie vírusovej zdatnosti pre budúce vznikajúce koronavírusy.

*Dôležitá POZNÁMKA:bioRxiv publikuje predbežné vedecké správy, ktoré nie sú recenzované odborníkmi, a preto by sa nemali považovať za presvedčivé, určené na usmernenie klinickej praxe/správania súvisiaceho so zdravím, alebo by sa s nimi nemalo zaobchádzať ako s overenými informáciami.

Referencia:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Cervantes, M. et al. (2022) „Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber biochemisch nicht für die SARS-CoV-2-Membranfusion erforderlich.“ bioRxiv. doi: 10.1101/2022.10.22.513347. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.22.513347v1