Študija kaže, da ACE-2 ni biokemično potreben za fuzijo membran SARS-CoV2

Študija kaže, da ACE-2 ni biokemično potreben za fuzijo membran SARS-CoV2

Študija, objavljena v bioRxiv * Strežniki za prednatis so preizkusili hipotezo, da receptor za angiotenzinsko pretvorbo encima-2 (ACE-2) pri hudem akutnem respiratornem sindromu koronavirusa 2 (SARS-CoV-2) ni le vezni dejavnik pri virusnih okužbah, ampak ima tudi vlogo pri aktiviranju virusnega koničastega proteina za lažjo fuzijo membrane.

Studie: Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber für die SARS-CoV-2-Membranfusion biochemisch nicht erforderlich. Bildquelle: Kateryna Kon/Shutterstock

*Pomembna OPOMBA:bioRxiv objavlja predhodna znanstvena poročila, ki niso strokovno pregledana in se zato ne bi smela šteti za dokončna, namenjena usmerjanju klinične prakse/vedenja v zvezi z zdravjem ali jih obravnavati kot uveljavljene informacije.

ozadje

Virus SARS-CoV-2 okuži človeške celice s pomočjo gostiteljevega receptorja ACE-2. Virusni konični protein nadzoruje vstop SARS-CoV-2 in okužbo z vezavo na receptorje ACE-2 na površini človeške celice. ACE-2 se aktivira s proteolitično cepitvijo in poganja fuzijo med celično membrano in virusno ovojnico.

Dokazi iz študij kažejo, da ACE-2 morda ne služi le kot vezni faktor, ampak lahko tudi pomaga aktivirati konični protein SARS-CoV-2 za zlitje membrane. Boljše razumevanje vloge ACE-2 pri fuziji membran lahko pomaga ponazoriti mehanizem za okužbo s SARS-CoV-2 in napovedati prihodnji razvoj SARS-CoV-2 in drugih podobnih virusov.

Študija

V tej študiji so raziskovalci uporabili deoksiribonukleinsko kislino (DNK)-lipidne vezi, ker se lahko nepovratno vstavijo v membrane in omogočijo programabilno samosestavljanje.

Ta pristop omogoča, da se komplementarne verige DNA, konjugirane z lipidi, vstavijo v virusne delce, kar omogoča sintetičnim liposomom, da ciljajo na delce brez potrebe po fizioloških receptorjih. Sprožilci, potrebni za fuzijo, se nato kemično rekonstituirajo in testirajo. Fuzijo zaznamo z enovirusno optično mikroskopijo, pri kateri se spremembe v stanju virusa med fuzijo spremljajo s fluorescentnimi barvili. Raziskovalci so predhodno uporabili pristop vezave DNA-lipidov za karakterizacijo virusnega vstopa različnih družin virusov, vključno s flavivirusi in ortomiksovirusi.

Raziskovalci so uporabili sintetične liposome za merjenje od konic odvisne vezave in fuzije na sintetične in celične membrane, da bi zagotovili odsotnost receptorja ACE-2. V poskusih so bili uporabljeni trije konici SARS-CoV-2 - D614G/N501Y, Wuhan in Omicron (B.1.1.529) - in dve vrsti virusnih delcev - virusom podobni delci (VLP), ki nastanejo z izražanjem psevdovirusov proteinov S, M, E in N na jedru HIV.

Ekipa je ločeno inkubirala ciljne membrane in virusne delce s komplementarnimi verigami DNK, konjugiranimi z lipidi DPPE. Imobilizirali so ciljne membrane v mikrofluidni pretočni celici in s tem omogočili vezavo virusnih delcev.

Rezultati

Ugotovljeno je bilo, da so se fuzijski dogodki zgodili le, ko so bili virusni delci vezani na ciljne membrane in je bila prisotna proteaza. Fuzijo smo spremljali predvsem z uporabo mešanice lipidov med tarčno membrano in virusnim delcem in jo zaznali z gašenjem barvila Texas Red v ovojnici virusa, kar je povzročilo izboljšanje fluorescence. Z DNA posredovana virusna vezava ACE-2 je bila specifična; Število adsorbiranih delcev se je zmanjšalo za več kot 25-krat, ko je bila DNK izpuščena. Prav tako ni prišlo do fuzijskih dogodkov v odsotnosti eksogene proteaze.

Pri primerjavi virusne fuzijske kinetike konic Omicron in Wuhan, psevdotipiziranih na jedrih HIV, in VLP-jev Wuhan D614G/N501Y, uporabljenih v tej študiji, je ekipa ugotovila, da čeprav sta imela oba psevdovirusa podobne stopnje zlitja, so VLP-ji dali nekoliko, a znatno hitrejše stopnje zlitja.

Opažena razlika v stopnjah zlitja je lahko posledica različnih dejavnikov, vključno z variacijami v gostoti konic na VLP v primerjavi z jedrom HIV, proteinoma E in M ​​v VLP, mutacijami D614G/N501Y in aktivnim odstotkom konic na površini VLP.

Ko se je proteaza, uporabljena za aktivacijo, spreminjala v poskusih Omicron in Wuhan, hitrosti fuzije niso bile občutljive na koncentracijo proteaze v območju od 200 do 1000 µg/ml. V skladu s prejšnjimi poročili transmembranska proteaza serin 2 (TMPRSS2) ni bila učinkovita pri aktiviranju omikronskih konic za fuzijo membran. Vendar je v primeru delcev D614G/N501Y dodatek 40 μg/mL TMPRSS2 povzročil drugačno kinetiko fuzije kot 200 μg/mL tripsina.

Ta opažanja kažejo, da proteolitično cepitev morda ni stopnja, ki omejuje hitrost membranske fuzije VLP-jev, vezanih na DNA, ker bi morala sprememba koncentracije proteaze vplivati ​​na tvorbo kompleksa encim-substrat, spremembe v identiteti proteaze pa bi morale spremeniti kinetiko fuzije.

Ko je bil proteazi sočasno dodan topni ACE-2, so opazili znatno povečanje hitrosti kinetike mešanja lipidov v poskusih Wuhan in Omicron. To kaže, da čeprav so konformacije koničastih proteinov, potrebne za fuzijo membran, dostopne brez ACE-2, receptor ACE-2 spodbuja konformacije konic, ki dajejo prednost fuziji membran.

Diploma

Na splošno so raziskovalci ugotovili, da psevdovirusi SARS-CoV-2 in VLP ne potrebujejo ACE-2 za fuzijo membrane, če se aktivirajo z ustrezno proteazo. Vendar pa je dodatek topnega ACE-2 pospešil reakcijo fuzije v sevu Wuhan SARS-CoV-2 in različici Omicron. Rezultati kinetične analize so pokazali, da obstajata vsaj dva koraka, ki omejujeta hitrost za fuzijo virusne membrane. Eden od korakov je bil odvisen od ACE-2, drugi pa ne.

Zgornji rezultati potrjujejo, da receptor ACE-2 ni biokemično potreben za fuzijo membrane SARS-CoV-2, če je prisoten alternativni vezni faktor. Ker pa ACE-2 deluje kot faktor z visoko afiniteto za pritrditev virusa na človeške celice, lahko njegova zamenjava z drugimi pritrdilnimi faktorji vpliva na razvoj SARS-CoV-2 in okolje primernosti virusa za prihodnje nastajajoče koronaviruse.

*Pomembna OPOMBA:bioRxiv objavlja predhodna znanstvena poročila, ki niso strokovno pregledana in se zato ne bi smela šteti za dokončna, namenjena usmerjanju klinične prakse/vedenja v zvezi z zdravjem ali jih obravnavati kot uveljavljene informacije.

Referenca:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Cervantes, M. et al. (2022) „Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber biochemisch nicht für die SARS-CoV-2-Membranfusion erforderlich.“ bioRxiv. doi: 10.1101/2022.10.22.513347. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.22.513347v1