Studie visar att ACE-2 inte är biokemiskt nödvändigt för SARS-CoV2-membranfusion

Studie visar att ACE-2 inte är biokemiskt nödvändigt för SARS-CoV2-membranfusion

En studie publicerad i bioRxiv * Preprint-servrar testade hypotesen att receptorn för det allvarliga akuta respiratoriska syndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2) angiotensinomvandlande enzym-2 (ACE-2) inte bara är en bindande faktor vid virusinfektioner utan också spelar en roll för att aktivera viralt spikprotein för att underlätta membranfusionen.

Studie: Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber für die SARS-CoV-2-Membranfusion biochemisch nicht erforderlich. Bildquelle: Kateryna Kon/Shutterstock

*Viktig OBS:bioRxiv publicerar preliminära vetenskapliga rapporter som inte är peer-reviewed och därför inte ska anses vara avgörande, avsedda att vägleda klinisk praxis/hälsorelaterat beteende eller behandlas som etablerad information.

bakgrund

SARS-CoV-2-viruset infekterar mänskliga celler med hjälp av värdens ACE-2-receptor. Det virala spikeproteinet kontrollerar SARS-CoV-2-inträde och infektion genom att binda till ACE-2-receptorerna på ytan av den mänskliga cellen. ACE-2 aktiveras av proteolytisk klyvning och driver fusion mellan cellmembranet och virushöljet.

Bevis från studier tyder på att ACE-2 inte bara kan fungera som en bindande faktor utan också kan hjälpa till att aktivera SARS-CoV-2 spikproteinet för membranfusion. En bättre förståelse för rollen av ACE-2 i membranfusion kan hjälpa till att illustrera mekanismen bakom SARS-CoV-2-infektion och förutsäga den framtida utvecklingen av SARS-CoV-2 och andra liknande virus.

Studien

I den aktuella studien använde forskare deoxiribonukleinsyra (DNA)-lipidbindningar eftersom de kan infogas irreversibelt i membran och möjliggöra programmerbar självmontering.

Detta tillvägagångssätt tillåter att komplementära DNA-strängar konjugerade till lipider infogas i virala partiklar, vilket tillåter syntetiska liposomer att rikta in sig på partiklarna utan behov av fysiologiska receptorer. De utlösare som behövs för fusion rekonstitueras sedan kemiskt och testas. Fusion detekteras med enkelvirus optisk mikroskopi, där förändringar i virustillstånd under fusion övervakas med fluorescerande färgämnen. Forskare har tidigare använt DNA-lipid-tjudningsmetoden för att karakterisera virusintrång i olika virusfamiljer, inklusive flavivirus och ortomyxovirus.

Forskarna använde syntetiska liposomer för att mäta spikberoende bindning och fusion till syntetiska och cellulära membran för att säkerställa frånvaron av ACE-2-receptorn. Tre SARS-CoV-2-spikar - D614G/N501Y, Wuhan och Omicron (B.1.1.529) - och två viruspartikeltyper - virusliknande partiklar (VLP) producerade genom uttryck av S-, M-, E- och N-proteiner pseudovirus på en HIV-kärna - användes i experimenten.

Teamet inkuberade separat målmembran och viruspartiklar med komplementära DNA-strängar konjugerade till DPPE-lipider. De immobiliserade målmembran i en mikrofluidisk flödescell, vilket gjorde det möjligt för viruspartiklarna att binda.

Resultat

Det visade sig att fusionshändelser endast inträffade när viruspartiklar var bundna till målmembran och proteas var närvarande. Fusion övervakades primärt med användning av lipidblandningen mellan målmembranet och viruspartikeln och detekterades genom att släcka Texas Red-färgämnet i virushöljet, vilket resulterade i fluorescensförstärkning. DNA-medierad viral ACE-2-bindning var specifik; Antalet adsorberade partiklar minskade mer än 25 gånger när DNA utelämnades. På samma sätt inträffade inga fusionshändelser i frånvaro av exogent proteas.

När man jämförde den virala fusionskinetiken för Omicron- och Wuhan-spikarna pseudotypade på HIV-kärnor och Wuhan D614G/N501Y VLPs som användes i denna studie, fann teamet att medan båda pseudovirusen hade liknande fusionshastigheter, gav VLP:erna något men betydligt snabbare fusionshastigheter.

Den observerade skillnaden i fusionshastigheter kan bero på en mängd olika faktorer, inklusive variationer i spikproteindensitet på VLP:erna jämfört med HIV-kärnan, E- och M-proteinerna i VLP:erna, D614G/N501Y-mutationerna och den aktiva spikeprocenten på VLP-ytan.

När proteaset som användes för aktivering varierades i Omicron- och Wuhan-experimenten, var fusionshastigheterna inte känsliga för proteaskoncentrationer i intervallet 200 till 1000 µg/ml. I överensstämmelse med tidigare rapporter var transmembranproteaset serin 2 (TMPRSS2) inte effektivt för att aktivera omicron-spikar för membranfusion. Men i fallet med D614G/N501Y-partiklar resulterade tillsatsen av 40 μg/mL TMPRSS2 i en annan fusionskinetik än 200 μg/mL trypsin.

Dessa observationer tyder på att proteolytisk klyvning kanske inte är det hastighetsbegränsande steget för membranfusion av DNA-bundna VLP eftersom en förändring i proteaskoncentrationen bör påverka bildningen av enzym-substratkomplexet och förändringar i proteasidentitet bör förändra fusionskinetiken.

När lösligt ACE-2 samtidigt tillsattes till proteaset observerades en signifikant ökning av hastigheten av lipidblandningskinetik i Wuhan- och Omicron-spiksexperiment. Detta visar att även om spikproteinkonformationerna som krävs för membranfusion är tillgängliga utan ACE-2, främjar ACE-2-receptorn spikkonformationer som gynnar membranfusion.

Diplom

Sammantaget fann forskarna att SARS-CoV-2-pseudovirus och VLP inte kräver ACE-2 för membranfusion när de aktiveras med ett lämpligt proteas. Men tillsatsen av lösligt ACE-2 accelererade fusionsreaktionen i Wuhan SARS-CoV-2-stammen och Omicron-varianten. Resultaten av den kinetiska analysen visade att det finns minst två hastighetsbegränsande steg för viral membranfusion. Ett av stegen var ACE-2-beroende, det andra inte.

Ovanstående resultat bekräftar att ACE-2-receptorn inte är biokemiskt nödvändig för SARS-CoV-2-membranfusion när en alternativ bindningsfaktor är närvarande. Men eftersom ACE-2 fungerar som en högaffinitetsfaktor för virusbindning till mänskliga celler, kan dess ersättning med andra fästfaktorer påverka utvecklingen av SARS-CoV-2 och den virala fitnessmiljön för framtida framväxande coronavirus.

*Viktig OBS:bioRxiv publicerar preliminära vetenskapliga rapporter som inte är peer-reviewed och därför inte ska anses vara avgörande, avsedda att vägleda klinisk praxis/hälsorelaterat beteende eller behandlas som etablerad information.

Hänvisning:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Cervantes, M. et al. (2022) „Der ACE-2-Rezeptor beschleunigt, ist aber biochemisch nicht für die SARS-CoV-2-Membranfusion erforderlich.“ bioRxiv. doi: 10.1101/2022.10.22.513347. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.22.513347v1