Εξέταση των στοιχείων για συνθετική προέλευση του SARS-CoV-2

Εξέταση των στοιχείων για συνθετική προέλευση του SARS-CoV-2

Σε πρόσφατη μελέτη που δημοσιεύτηκε στο bioRxiv * Διακομιστής προεκτύπωσης: Οι ερευνητές ερεύνησαν εάν το σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο κοροναϊός 2 (SARS-CoV-2) προέκυψε φυσικά μέσω μετάδοσης από ζώο σε άνθρωπο ή συνθετικά κατά τη διάρκεια ερευνητικών πειραμάτων για τον κορωνοϊό (CoV).

Studie: Endonuklease-Fingerabdruck weist auf einen synthetischen Ursprung von SARS-CoV-2 hin. Bildnachweis: Lightspring/Shutterstock

*Σημαντική ΣΗΜΕΙΩΣΗ:Το bioRxiv δημοσιεύει προκαταρκτικές επιστημονικές εκθέσεις που δεν έχουν αξιολογηθεί από ομοτίμους και επομένως δεν πρέπει να θεωρούνται πειστικές, που προορίζονται να καθοδηγήσουν την κλινική πρακτική/σχετική με την υγεία συμπεριφορά ή να αντιμετωπίζονται ως καθιερωμένες πληροφορίες.

Οι ερευνητές χρησιμοποιούν συχνά τη μέθοδο συναρμολόγησης γονιδιώματος in vitro (IVGA) για τη συνθετική μηχανική των παραλλαγών του CoV στο εργαστήριο. Η τεχνική χρησιμοποιεί περιοριστικά ένζυμα για να δημιουργήσει δομικά στοιχεία δεοξυριβονουκλεϊκού οξέος (DNA), τα οποία στη συνέχεια μπορούν να συναρμολογηθούν με τακτοποιημένο τρόπο για τη δημιουργία του ιικού γονιδιώματος.

Για τη δημιουργία ιών συνθετικά, το ιικό γονιδίωμα τροποποιείται με τέτοιο τρόπο ώστε οι περιοχές ραφής, οι λεγόμενες θέσεις περιορισμού (RS), εξαλείφονται ή ενσωματώνονται. Οι τροποποιήσεις RS θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως δακτυλικά αποτυπώματα IVGA και για την πρόληψη μελλοντικών πανδημιών, η κατανόηση της προέλευσης του SARS-CoV-2 είναι κρίσιμης σημασίας.

Σχετικά με τη μελέτη

Στην παρούσα μελέτη, οι ερευνητές εξέτασαν εάν η προέλευση του SARS-CoV-2 ήταν φυσική ή συνθετική χρησιμοποιώντας μια κοινή μέθοδο IVGA σε κλώνους μολυσματικού ιού ριβονουκλεϊκού οξέος (RNA).

Το πλήρες γονιδίωμα του RNA ανακατασκευάστηκε σε DNA από το IVGA για τη δημιουργία μολυσματικών εκδόσεων CoV. Χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικά ένζυμα ενδονουκλεάσης για τη συναρμολόγηση του ιικού γονιδιώματος, με δύο θέσεις ενός ενζύμου να πλαισιώνουν τη θέση ενδιαφέροντος για να επιτρέπεται ο αποτελεσματικός χειρισμός της πλευρικής περιοχής χωρίς να επανασυναρμολογηθεί ολόκληρη η ραχοκοκαλιά του ιού για κάθε παραλλαγή.

Η ομάδα υπολόγισε τυχαίες κατανομές RS που θα ήταν αναμενόμενες σε μη τροποποιημένους ιούς μετά την πέψη ενός ευρέος φάσματος φυσικών γονιδιωμάτων του CoV με μια ολοκληρωμένη λίστα ενζύμων περιοριστικών ενδονουκλεασών. Το αντίστροφο γενετικό σύστημα MERS-CoV (Middle East Respiratory Syndrome CoV) σχεδιάστηκε για IVGA αφαιρώντας τις υπάρχουσες θέσεις BglI, εισάγοντας έξι επιπλέον θέσεις BglI και ομοιόμορφα κατανεμημένους τύπους IIS RS.

Οι προσθήκες και οι αφαιρέσεις πραγματοποιήθηκαν με μεταλλάξεις συνωνύμου τύπου, δημιουργώντας επτά θραύσματα, το μεγαλύτερο από τα οποία είχε μήκος 5721 ζεύγη βάσεων (bp) ή κάλυπτε το 19% του γονιδιώματος MERS. Η ανάλυση επικεντρώθηκε σε τοποθεσίες SARS-CoV-2 BsaI/BsmBI σε σύγκριση με τους χάρτες RS όλων των CoV. Η ανάλυση μετάλλαξης πραγματοποιήθηκε με τη δημιουργία 100.000 τυχαίων μεταλλαγμάτων πυριτίου για RaTG13 και BANAl-20-52. Η φυλογενετική ανάλυση συμπερασμάτων διεξήχθη χρησιμοποιώντας ευθυγραμμίσεις ολόκληρου του γονιδιώματος κατά ζεύγη μεταξύ RaTG13 και SARS-CoV-2 και BANAL-20-52 και SARS-CoV-2 που χωνεύτηκαν από BsaI/BsmBI.

Για την ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν δεδομένα αποθετηρίου Github των κατασκευασμένων CoV και τα ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (ORF) του γονιδίου ακίδας CoV (S) ανακτήθηκαν από τη γενετική βάση δεδομένων NCBI. Έγινε αναζήτηση στο Google Scholar για την παραγωγή μιας πλήρως αντιπροσωπευτικής λίστας παραδειγμάτων μολυσματικών κλώνων CoV που περιορίστηκαν μεταξύ 2000 και 2019.

Αποτελέσματα

Το συνθετικό δακτυλικό αποτύπωμα SARS-CoV-2 ήταν ανώμαλο σε CoVs άγριου τύπου (wt) και κοινό σε ιικούς οργανισμούς που έχουν κατασκευαστεί από εργαστήριο. Ο χάρτης RS του SARS-CoV-2 ήταν συνεπής με εκείνους που είχαν αναφερθεί προηγουμένως για συνθετικά γονιδιώματα CoV, πληρούσε όλα τα απαραίτητα κριτήρια για ένα αποτελεσματικό αντίστροφο γενετικό σύστημα και ξεχώριζε σαφώς από τους στενότερους συγγενείς του από ένα υψηλό ποσοστό θέσεων ταυτοποίησης που ήταν συνώνυμες αλλά υπήρχαν στη συνθετική μορφή. και είναι απίθανο το αποτύπωμα να προήλθε από στενούς συγγενείς του.

Στην ανάλυση χάρτη RS, το δακτυλικό αποτύπωμα IVGA SARS-CoV-2 έδειξε (i) ενσωμάτωση ή/και εξάλειψη μοναδικών ενζύμων ενδονουκλεάσης (BsmBI, BglI και BsaI). (ii) πέψη με επιλεγμένα ένζυμα, με αποτέλεσμα πέντε έως οκτώ θραύσματα. (iii) το μεγαλύτερο θραύσμα είναι < οκτώ kb. (iv) όλα τα κολλώδη άκρα ήταν μοναδικά. (v) όλες οι θέσεις αναγνώρισης δημιουργήθηκαν από συνώνυμες μεταλλάξεις. (vi) δύο μοναδικές τοποθεσίες αναγνώρισης θα μπορούσαν να πλαισιώνουν τοποθεσίες για περαιτέρω χειρισμό· (vii) Οι θέσεις αναγνώρισης θα μπορούσαν να ευθυγραμμιστούν με άλλους ιικούς οργανισμούς για να επιτραπούν οι υποκαταστάσεις τμημάτων.

Το μοτίβο των σιωπηλών ή συνώνυμων μοτίβων και του δακτυλικού αποτυπώματος της περιοχής περιορισμού ήταν σχεδόν καθολικό μεταξύ των συνθετικών ιικών οργανισμών, υποδηλώνοντας έντονα ότι ο SARS-CoV-2 προέκυψε συνθετικά. Ο χάρτης SARS-CoV-2 RS περιείχε πέντε BsaI/BsmBI RS. Σε αντίθεση με τους στενά συγγενείς ιούς, οι ιοί κατανεμήθηκαν ομοιόμορφα και δεν είχαν δύο εξαιρετικά διατηρημένα BsaI-RS που υπάρχουν σε όλους σχεδόν τους άλλους σαρβεκοϊούς της σειράς Β. Ο χάρτης ήταν ακραίος στο κατώτατο 1,0% των μεγαλύτερων μηκών θραυσμάτων των αχειροποίητων CoVs.

Η ανάλυση χαρτών περιορισμού 1491 χαρτών RS στην κατανομή βάρους των IIS έδειξε ότι ο SARS-CoV-2 ήταν πιο SD (τυπικές αποκλίσεις) κάτω από τον μέσο όρο σε σύγκριση με κάθε μη χειριζόμενο ιικό οργανισμό, υποδεικνύοντας <0,1% πιθανότητα μιας τέτοιας ανωμαλίας RS σε έναν wt, αχειροποίητο ιό. Ο SARS-CoV-2 έδειξε έξι θραύσματα που υπέστησαν διπλή πέψη από ένζυμα περιοριστικής ενδονουκλεάσης τύπου IIS και οι στενοί συγγενείς RaTG13 και BANAL 52 έδειξαν επτά και πέντε θραύσματα με έντονο RS, αντίστοιχα.

Παρατηρήθηκαν 12 σιωπηλές μεταλλάξεις σε εννέα διαφορετικά BsaI/BsmBI RS μεταξύ SARS-CoV-2 και RaTG13 και πέντε σιωπηλές μεταλλάξεις σε επτά διαφορετικά BsaI/BsmBI RS μεταξύ SARS-CoV-2 και BANAL52. Μόνο το ένα τοις εκατό και το 0,1 τοις εκατό των μεταλλαγμάτων RaTG13 και BANAL52, αντίστοιχα, έδειξαν χάρτες BsaI/BsmBI RS με υψηλότερες βαθμολογίες Z σε σύγκριση με τον SARS-CoV-2.

Συνολικά, τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν μεγάλη πιθανότητα ο SARS-CoV-2 να προκύπτει συνθετικά ως μολυσματικός κλώνος που συναρμολογείται in vitro. Τα αποτελέσματα θα μπορούσαν να υποστηρίξουν τη χάραξη πολιτικής και την έρευνα για την πρόληψη μελλοντικών πανδημιών και την προώθηση βελτιώσεων στη βιοασφάλεια παγκοσμίως.

*Σημαντική ΣΗΜΕΙΩΣΗ:Το bioRxiv δημοσιεύει προκαταρκτικές επιστημονικές εκθέσεις που δεν έχουν αξιολογηθεί από ομοτίμους και επομένως δεν πρέπει να θεωρούνται πειστικές, που προορίζονται να καθοδηγήσουν την κλινική πρακτική/σχετική με την υγεία συμπεριφορά ή να αντιμετωπίζονται ως καθιερωμένες πληροφορίες.

Αναφορά:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Valentin Bruttel, Alex Washburne und Antonius VanDongen. (2022). Endonuklease-Fingerabdruck weist auf einen synthetischen Ursprung von SARS-CoV-2 hin. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.10.18.512756 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.30.510261v3