Forskere udvikler menneskelige spytkirtelorganoider for at teste smitteevnen af ​​SARS-CoV-2

Forskere udvikler menneskelige spytkirtelorganoider for at teste smitteevnen af ​​SARS-CoV-2

I en undersøgelse for nylig offentliggjort i tidsskriftet Naturlig cellebiologi Forskere demonstrerede in vitro følsomheden af ​​spytkirtler for alvorlig akut respiratorisk syndrom coronavirus-2 (SARS-CoV-2) infektion ved hjælp af en organoid kulturmodel.

Studere: Human-inducerede pluripotente stamcelle-afledte spytkirtelorganoider model SARS-CoV-2 infektion og replikation. Fotokredit: NIAID

baggrund

Selvom åndedrætssystemet, herunder de øvre luftveje (URT) og lungerne, er hovedmålene for SARS-CoV-2, er der stigende beviser for, at det påvirker flere organer. For eksempel udtrykker oral slimhinde og spytkirtler i vid udstrækning to SARS-CoV-2-indgangsfaktorer, angiotensin-konverterende enzym 2 (ACE2) og transmembran serinprotease 2 (TMPRSS2). De tjener også som et reservoir for SARS-CoV-2.

Interessant nok er 80 % af SARS-CoV-2-infektioner asymptomatiske. Derudover har undersøgelser rapporteret, at SARS-CoV-2 er rettet mod menneskelige spytkirtler, og infektiøse virioner fra spyt fra asymptomatiske individer bidrager til yderligere virusoverførsel.

På grund af SARS-CoV-2's evne til at inficere flere typer organoider, kan en organoid kulturmodel vise sig egnet til at påvise infektion med SARS-CoV-2 i spytkirtler (in vitro). Men på grund af manglen på egnede in vitro-modeller har undersøgelser ikke kunnet belyse de mekanismer, der ligger til grund for infektionen og replikationen af ​​SARS-CoV-2 i spytkirtlerne og efterfølgende sekretion i spyt.

Om studiet

I denne undersøgelse genererede forskere funktionelle spytkirtelorganoider fra humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er) med lignende morfologiske egenskaber og fysiologiske funktioner (in vivo) til menneskelige spytkirtler. Desuden havde disse organoider spytkirtel-specifikke cellelinjer.

Holdet udførte enkeltcellede ribonukleinsyresekventering (scRNA-seq) af hiSG-celler på dag 80 ved hjælp af 10X Genomics-platformen. Derudover isolerede de organoiderne på dag 60 og dyrkede dem med fibroblast vækstfaktor (FGF) 7 og 10 indtil dag 80 for at karakterisere de observerede forgreningsstrukturer.

SRY-box transkriptionsfaktor 9 (SOX9) genet regulerer spytkirtlens udvikling hos mus og mennesker. I sit fravær kan spytkirtlerne ikke gennemgå forgrenende morfogenese. Derfor undertrykte forskerne SOX9 under hiSG-induktion for at finde ud af, om hiSGs rekapitulerede den SOX9-medierede udviklingsproces.

Studieresultater

De human-inducerede spytkirtler (hiSG'er) havde lignende egenskaber som embryonale spytkirtler, herunder morfologiske egenskaber, proteinmarkørekspression og genekspressionskarakteristika. I overensstemmelse med in vivo undersøgelser udført i mus, hæmmede SOX9 knockdown grendannelse i hiPSC'er, hvilket tyder på, at dette gen er kritisk for menneskelig spytkirteludvikling. Denne undersøgelsesmodel kunne således erstatte dyremodeller, der bruges til at studere menneskets spytkirteludvikling.

HiSG'erne efterlignede morfologisk og funktionelt naturlige spytkirtler. Uvildig scRNA-seq-klynger identificerede seks hovedcellegrupper, der er yderligere delbare i cellulære undertyper. Den lille mesenchymale population i HiSG'erne viste ikke træk ved spytkirtelmesenchym. I modsætning hertil bestod epitelcellegruppen af ​​fem cellegrupper: acinære, basale, ductale, myoepitelceller og aktivt cykliske celler. HiSG'erne omfattede uafhængige afstamninger af basale myoepitelceller fra den duktale-acinære linje, og pseudotidsanalyse viste forskellene mellem disse to cellelinjer.

Spytkirtlernes grundlæggende funktion er at udskille acetylcholin-induceret væske via muskarine acetylcholin-receptorveje. I hiSG'er resulterede behandling med carbachol, en muskarin acetylcholinreceptoragonist, i en forbigående og dosisafhængig stigning i intracellulære calciumniveauer. Desuden udviste ortotopisk transplanterede hiSG'er fænotypen af ​​modne spytkirtler transplanteret til et modtagersted i mus over tid.

ScRNA-seq og immunfluorescensanalyser viste også, at de ductale celler i hiSG'erne i rigelige mængder udtrykte ACE2 og TMPRSS2, svarende til normale spytkirtler. Immunfarvningsmetoden afslørede, at selvom duktale celler på den apikale side af hiSG'er stærkt udtrykte ACE2, udtrykte duktale celler og acinære celler TMPRSS2. Ved kontakt med SARS-CoV-2 blev hiSG'er inficeret og viste SARS-CoV-2-replikation inden for 24 timer efter infektion. Forfatterne opdagede også SARS-CoV-2-nukleoproteinet i inficerede ductale celler. Følgelig viste medium infektiøs vævskulturanalyse (TCID50) infektiøse vira i hiSG'er, der toppede efter 24 timer, men faldt senere.

Konklusioner

Faktisk kunne hiSG'erne udviklet i den nuværende undersøgelse tjene som en værdifuld model for reproduktion af heterogene cellepopulationer i menneskelige spytkirtler. Desuden kunne hiSG'er understøtte den funktionelle analyse af gener under udvikling og tjene som et lovende værktøj til at studere SARS-CoV-2-infektioner i spytkirtler på molekylært niveau. Derudover viste forskerne, at hiSG'er havde flere fordele sammenlignet med organoider afledt af vævsstamceller fra voksne menneskelige spytkirtler. For eksempel kunne de let genetisk modificeres ved hjælp af genredigeringsværktøjet CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) og CRISPR-associeret protein 9 (Cas9) og var relativt nemme at dyrke.

Reference:

• Tanaka, J., Senpuku, H., Ogawa, M. et al. Vom Menschen induzierte pluripotente, aus Stammzellen gewonnene Speicheldrüsenorganoide modellieren die SARS-CoV-2-Infektion und -Replikation. Nat Cell Biol (2022). https://doi.org/10.1038/s41556-022-01007-6, https://www.nature.com/articles/s41556-022-01007-6#Sec7