Οι επιστήμονες αναπτύσσουν οργανοειδή ανθρώπινων σιελογόνων αδένων για να δοκιμάσουν τη μολυσματικότητα του SARS-CoV-2

Οι επιστήμονες αναπτύσσουν οργανοειδή ανθρώπινων σιελογόνων αδένων για να δοκιμάσουν τη μολυσματικότητα του SARS-CoV-2

Σε μια μελέτη που δημοσιεύτηκε πρόσφατα στο περιοδικό Φυσική κυτταρική βιολογία Οι ερευνητές απέδειξαν in vitro την ευαισθησία των σιελογόνων αδένων σε λοίμωξη από σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο κοροναϊού-2 (SARS-CoV-2) χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο οργανοειδούς καλλιέργειας.

Μελέτη: Πολυδύναμα οργανοειδή σιελογόνων αδένων που προέρχονται από ανθρώπινα βλαστοκύτταρα μοντέλο μόλυνσης και αναπαραγωγής SARS-CoV-2. Φωτογραφία: NIAID

φόντο

Αν και το αναπνευστικό σύστημα, συμπεριλαμβανομένης της ανώτερης αναπνευστικής οδού (URT) και των πνευμόνων, είναι οι κύριοι στόχοι του SARS-CoV-2, υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι επηρεάζει πολλαπλά όργανα. Για παράδειγμα, ο στοματικός βλεννογόνος και οι σιελογόνοι αδένες εκφράζουν ευρέως δύο παράγοντες εισόδου SARS-CoV-2, το ένζυμο μετατροπής της αγγειοτενσίνης 2 (ACE2) και τη διαμεμβρανική πρωτεάση της σερίνης 2 (TMPRSS2). Λειτουργούν επίσης ως δεξαμενή για τον SARS-CoV-2.

Είναι ενδιαφέρον ότι το 80% των λοιμώξεων SARS-CoV-2 είναι ασυμπτωματικές. Επιπλέον, μελέτες έχουν αναφέρει ότι ο SARS-CoV-2 στοχεύει ανθρώπινους σιελογόνους αδένες και μολυσματικά ιοσωμάτια από το σάλιο ασυμπτωματικών ατόμων συμβάλλουν στην περαιτέρω μετάδοση του ιού.

Λόγω της ικανότητας του SARS-CoV-2 να μολύνει πολλαπλούς τύπους οργανοειδών, ένα μοντέλο οργανοειδούς καλλιέργειας μπορεί να αποδειχθεί κατάλληλο για την ανίχνευση μόλυνσης από τον SARS-CoV-2 σε σιελογόνους αδένες (in vitro). Ωστόσο, λόγω της έλλειψης κατάλληλων μοντέλων in vitro, οι μελέτες απέτυχαν να αποσαφηνίσουν τους μηχανισμούς που κρύβονται πίσω από τη μόλυνση και την αναπαραγωγή του SARS-CoV-2 στους σιελογόνους αδένες και την επακόλουθη έκκριση στο σάλιο.

Σχετικά με τη μελέτη

Στην παρούσα μελέτη, οι ερευνητές δημιούργησαν λειτουργικά οργανοειδή σιελογόνων αδένων από ανθρώπινα επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (hiPSCs) με παρόμοια μορφολογικά χαρακτηριστικά και φυσιολογικές λειτουργίες (in vivo) με τους ανθρώπινους σιελογόνους αδένες. Επιπλέον, αυτά τα οργανοειδή είχαν κυτταρικές σειρές ειδικές για τους σιελογόνους αδένες.

Η ομάδα πραγματοποίησε αλληλουχία ριβονουκλεϊκού οξέος ενός κυττάρου (scRNA-seq) κυττάρων hiSG την ημέρα 80 χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα 10X Genomics. Επιπλέον, απομόνωσαν τα οργανοειδή την ημέρα 60 και τα καλλιέργησαν με αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών (FGF) 7 και 10 μέχρι την ημέρα 80 για να χαρακτηρίσουν τις δομές διακλάδωσης που παρατηρήθηκαν.

Το γονίδιο SRY-box μεταγραφικού παράγοντα 9 (SOX9) ρυθμίζει την ανάπτυξη των σιελογόνων αδένων σε ποντίκια και ανθρώπους. Ελλείψει αυτού, οι σιελογόνοι αδένες δεν μπορούν να υποστούν διακλαδωτική μορφογένεση. Ως εκ τούτου, οι ερευνητές κατέστειλαν το SOX9 κατά τη διάρκεια της επαγωγής του hiSG για να μάθουν εάν τα hiSG ανακεφαλαίωσαν τη διαδικασία ανάπτυξης που διαμεσολαβείται από το SOX9.

Αποτελέσματα μελέτης

Οι σιελογόνοι αδένες που προκαλούνται από τον άνθρωπο (hiSGs) είχαν παρόμοιες ιδιότητες με τους εμβρυϊκούς σιελογόνους αδένες, συμπεριλαμβανομένων των μορφολογικών χαρακτηριστικών, της έκφρασης δείκτη πρωτεϊνών και των χαρακτηριστικών έκφρασης γονιδίου. Σε συμφωνία με in vivo μελέτες που διεξήχθησαν σε ποντίκια, το SOX9 knockdown ανέστειλε το σχηματισμό κλαδιών στα hiPSC, υποδηλώνοντας ότι αυτό το γονίδιο είναι κρίσιμο για την ανάπτυξη των ανθρώπινων σιελογόνων αδένων. Έτσι, αυτό το μοντέλο μελέτης θα μπορούσε να αντικαταστήσει ζωικά μοντέλα που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη της ανάπτυξης των ανθρώπινων σιελογόνων αδένων.

Τα hiSG μιμούνταν μορφολογικά και λειτουργικά τους φυσικούς σιελογόνους αδένες. Η αμερόληπτη ομαδοποίηση scRNA-seq εντόπισε έξι κύριες κυτταρικές ομάδες που διαιρούνται περαιτέρω σε κυτταρικούς υποτύπους. Ο μικρός μεσεγχυματικός πληθυσμός στα HiSG δεν εμφάνισε χαρακτηριστικά μεσεγχύματος σιελογόνων αδένων. Αντίθετα, η ομάδα των επιθηλιακών κυττάρων αποτελούνταν από πέντε κυτταρικές ομάδες: κυψελοειδή, βασικά, πόρων, μυοεπιθηλιακά και ενεργά κυκλικά κύτταρα. Τα hiSGs περιελάμβαναν ανεξάρτητες σειρές βασικών μυοεπιθηλιακών κυττάρων από τη γραμμή του πόρου-ακινάριου και η ανάλυση ψευδοχρόνου έδειξε τις διαφορές μεταξύ αυτών των δύο κυτταρικών σειρών.

Η βασική λειτουργία των σιελογόνων αδένων είναι να εκκρίνουν υγρό που προκαλείται από ακετυλοχολίνη μέσω των οδών μουσκαρινικού υποδοχέα ακετυλοχολίνης. Στα hiSG, η θεραπεία με καρβαχόλη, έναν μουσκαρινικό αγωνιστή υποδοχέα ακετυλοχολίνης, είχε ως αποτέλεσμα μια παροδική και δοσοεξαρτώμενη αύξηση στα ενδοκυτταρικά επίπεδα ασβεστίου. Επιπλέον, τα ορθοτοπικά μεταμοσχευμένα hiSG εμφάνισαν τον φαινότυπο των ώριμων σιελογόνων αδένων που μεταμοσχεύθηκαν σε μια θέση δέκτη σε ποντίκια με την πάροδο του χρόνου.

Οι αναλύσεις scRNA-seq και ανοσοφθορισμού έδειξαν επίσης ότι τα κύτταρα του πόρου εντός των hiSGs εξέφραζαν άφθονα ACE2 και TMPRSS2, παρόμοια με τους φυσιολογικούς σιελογόνους αδένες. Η μέθοδος ανοσοχρώσης αποκάλυψε ότι παρόλο που τα κύτταρα του πόρου στην κορυφαία πλευρά των hiSGs εξέφραζαν έντονα το ACE2, τα κύτταρα του πόρου και τα κύτταρα του βλεννογόνου εξέφραζαν το TMPRSS2. Κατά την επαφή με τον SARS-CoV-2, τα hiSG μολύνθηκαν και έδειξαν αντιγραφή του SARS-CoV-2 εντός 24 ωρών από τη μόλυνση. Οι συγγραφείς ανακάλυψαν επίσης τη νουκλεοπρωτεΐνη SARS-CoV-2 σε μολυσμένα κύτταρα του πόρου. Αντίστοιχα, ο προσδιορισμός καλλιέργειας μέσου μολυσματικού ιστού (TCID50) έδειξε μολυσματικούς ιούς στα hiSG που κορυφώθηκαν στις 24 ώρες αλλά μειώθηκαν αργότερα.

συμπεράσματα

Στην πραγματικότητα, τα hiSG που αναπτύχθηκαν στην τρέχουσα μελέτη θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως πολύτιμο μοντέλο για την αναπαραγωγή ετερογενών πληθυσμών κυττάρων σε ανθρώπινους σιελογόνους αδένες. Επιπλέον, τα hiSGs θα μπορούσαν να υποστηρίξουν τη λειτουργική ανάλυση των γονιδίων κατά την ανάπτυξη και να χρησιμεύσουν ως ένα πολλά υποσχόμενο εργαλείο για τη μελέτη των λοιμώξεων SARS-CoV-2 σε σιελογόνους αδένες σε μοριακό επίπεδο. Επιπλέον, οι ερευνητές έδειξαν ότι τα hiSGs είχαν πολλά πλεονεκτήματα σε σύγκριση με τα οργανοειδή που προέρχονται από προγονικά βλαστοκύτταρα ιστών από ενήλικους ανθρώπινους σιελογόνους αδένες. Για παράδειγμα, θα μπορούσαν εύκολα να τροποποιηθούν γενετικά χρησιμοποιώντας το εργαλείο γονιδιακής επεξεργασίας CRISPR (ομαδοποιημένες τακτικά διακεκομμένες σύντομες παλινδρομικές επαναλήψεις) και την πρωτεΐνη 9 (Cas9) που σχετίζεται με CRISPR και ήταν σχετικά εύκολο να καλλιεργηθούν.

Αναφορά:

• Tanaka, J., Senpuku, H., Ogawa, M. et al. Vom Menschen induzierte pluripotente, aus Stammzellen gewonnene Speicheldrüsenorganoide modellieren die SARS-CoV-2-Infektion und -Replikation. Nat Cell Biol (2022). https://doi.org/10.1038/s41556-022-01007-6, https://www.nature.com/articles/s41556-022-01007-6#Sec7