Znanstvenici razvijaju organoide ljudskih žlijezda slinovnica kako bi testirali infektivnost SARS-CoV-2

Znanstvenici razvijaju organoide ljudskih žlijezda slinovnica kako bi testirali infektivnost SARS-CoV-2

U studiji nedavno objavljenoj u časopisu Biologija prirodne stanice Istraživači su in vitro pokazali osjetljivost žlijezda slinovnica na infekciju teškim akutnim respiratornim sindromom koronavirusom-2 (SARS-CoV-2) koristeći model organoidne kulture.

Studija: Model infekcije i replikacije SARS-CoV-2 pluripotentnih organoidnih žlijezda slinovnica induciranih od ljudi. Autor fotografije: NIAID

pozadina

Iako su dišni sustav, uključujući gornje dišne ​​putove (URT) i pluća, glavne mete SARS-CoV-2, sve je više dokaza da on utječe na više organa. Na primjer, oralna sluznica i žlijezde slinovnice široko izražavaju dva ulazna faktora SARS-CoV-2, angiotenzin-konvertirajući enzim 2 (ACE2) i transmembransku serin proteazu 2 (TMPRSS2). Oni također služe kao rezervoar za SARS-CoV-2.

Zanimljivo je da je 80% infekcija SARS-CoV-2 asimptomatsko. Osim toga, studije su izvijestile da SARS-CoV-2 cilja na ljudske žlijezde slinovnice, a zarazni virioni iz sline asimptomatskih osoba doprinose daljnjem prijenosu virusa.

Zbog sposobnosti SARS-CoV-2 da inficira više vrsta organoida, model kulture organoida može se pokazati prikladnim za otkrivanje infekcije SARS-CoV-2 u žlijezdama slinovnicama (in vitro). Međutim, zbog nedostatka prikladnih in vitro modela, studije nisu uspjele razjasniti mehanizme koji stoje u osnovi infekcije i replikacije SARS-CoV-2 u žlijezdama slinovnicama i kasnijeg izlučivanja u slinu.

O studiju

U ovoj studiji, istraživači su generirali funkcionalne organoide žlijezda slinovnica iz ljudskih induciranih pluripotentnih matičnih stanica (hiPSC) sa sličnim morfološkim značajkama i fiziološkim funkcijama (in vivo) ljudskim žlijezdama slinovnicama. Nadalje, ti organoidi su imali stanične linije specifične za žlijezde slinovnice.

Tim je izveo jednostanično sekvenciranje ribonukleinske kiseline (scRNA-seq) hiSG stanica 80. dana koristeći platformu 10X Genomics. Osim toga, izolirali su organoide 60. dana i uzgajali ih s faktorom rasta fibroblasta (FGF) 7 i 10 do 80. dana kako bi karakterizirali uočene strukture grananja.

Gen SRY-box transkripcijskog faktora 9 (SOX9) regulira razvoj žlijezda slinovnica kod miševa i ljudi. U njegovom nedostatku, žlijezde slinovnice ne mogu proći kroz morfogenezu grananja. Stoga su istraživači potisnuli SOX9 tijekom indukcije hiSG kako bi saznali jesu li hiSG rekapitulirali razvojni proces posredovan SOX9.

Rezultati studije

Čovjekom izazvane žlijezde slinovnice (hiSGs) imale su slična svojstva kao embrionalne žlijezde slinovnice, uključujući morfološke karakteristike, ekspresiju proteinskog markera i karakteristike ekspresije gena. U skladu s in vivo studijama provedenim na miševima, nokdaun SOX9 inhibirao je formiranje grana u hiPSC-ima, što sugerira da je ovaj gen kritičan za razvoj ljudskih žlijezda slinovnica. Stoga bi ovaj studijski model mogao zamijeniti životinjske modele koji se koriste za proučavanje razvoja ljudskih žlijezda slinovnica.

HiSG su morfološki i funkcionalno oponašali prirodne žlijezde slinovnice. Nepristrano grupiranje scRNA-seq identificiralo je šest glavnih staničnih skupina koje se dalje dijele na stanične podtipove. Mala mezenhimalna populacija u HiSG nije pokazala značajke mezenhima žlijezda slinovnica. Nasuprot tome, skupina epitelnih stanica sastojala se od pet staničnih skupina: acinarne, bazalne, duktalne, mioepitelne i aktivno ciklične stanice. HiSG-ovi su se sastojali od neovisnih linija bazalnih mioepitelnih stanica iz duktalno-acinarne linije, a analiza pseudovremena pokazala je razlike između ove dvije stanične linije.

Osnovna funkcija žlijezda slinovnica je izlučivanje tekućine izazvane acetilkolinom putem muskarinskih acetilkolinskih receptorskih puteva. Kod hiSG-a, liječenje karbaholom, agonistom muskarinskih acetilkolinskih receptora, dovelo je do prolaznog i o dozi ovisnog povećanja unutarstaničnih razina kalcija. Nadalje, ortotopski transplantirani hiSGs pokazali su fenotip zrelih žlijezda slinovnica presađenih na mjesto primatelja u miševa tijekom vremena.

Analiza scRNA-seq i imunofluorescencije također su pokazale da su duktalne stanice unutar hiSG obilno eksprimirale ACE2 i TMPRSS2, slično normalnim žlijezdama slinovnicama. Metoda imunološkog bojenja otkrila je da iako duktalne stanice na apikalnoj strani hiSG-a snažno izražavaju ACE2, duktalne stanice i acinarne stanice izražavaju TMPRSS2. Nakon kontakta sa SARS-CoV-2, hiSG su se zarazili i pokazali replikaciju SARS-CoV-2 unutar 24 sata od infekcije. Autori su također otkrili nukleoprotein SARS-CoV-2 u zaraženim duktalnim stanicama. Sukladno tome, analiza srednje infektivne kulture tkiva (TCID50) pokazala je infektivne viruse u hiSG-ima koji su dosegli vrhunac nakon 24 sata, ali su se kasnije smanjili.

Zaključci

Zapravo, hiSG razvijeni u trenutnoj studiji mogu poslužiti kao vrijedan model za reprodukciju heterogenih staničnih populacija u ljudskim žlijezdama slinovnicama. Nadalje, hiSG bi mogao podržati funkcionalnu analizu gena tijekom razvoja i poslužiti kao obećavajući alat za proučavanje infekcija SARS-CoV-2 u žlijezdama slinovnicama na molekularnoj razini. Osim toga, istraživači su pokazali da hiSGs ima nekoliko prednosti u usporedbi s organoidima dobivenim iz matičnih progenitorskih stanica iz žlijezda slinovnica odraslih ljudi. Na primjer, mogli su se lako genetski modificirati korištenjem alata za uređivanje gena CRISPR (skupina pravilno raspoređenih kratkih palindromskih ponavljanja) i proteina 9 (Cas9) povezanog s CRISPR-om i relativno ih je lako uzgajati.

Referenca:

• Tanaka, J., Senpuku, H., Ogawa, M. et al. Vom Menschen induzierte pluripotente, aus Stammzellen gewonnene Speicheldrüsenorganoide modellieren die SARS-CoV-2-Infektion und -Replikation. Nat Cell Biol (2022). https://doi.org/10.1038/s41556-022-01007-6, https://www.nature.com/articles/s41556-022-01007-6#Sec7