Forskere utvikler menneskelige spyttkjertelorganoider for å teste smitteevnen til SARS-CoV-2

Forskere utvikler menneskelige spyttkjertelorganoider for å teste smitteevnen til SARS-CoV-2

I en studie nylig publisert i tidsskriftet Naturlig cellebiologi Forskere demonstrerte in vitro følsomheten til spyttkjertler for alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus-2 (SARS-CoV-2)-infeksjon ved å bruke en organoid kulturmodell.

Studere: Menneske-induserte pluripotente stamcelle-avledede spyttkjertelorganoider modell SARS-CoV-2 infeksjon og replikasjon. Bildekreditt: NIAID

bakgrunn

Selv om luftveiene, inkludert de øvre luftveiene (URT) og lungene, er hovedmålene for SARS-CoV-2, er det økende bevis på at det påvirker flere organer. For eksempel uttrykker munnslimhinnen og spyttkjertlene to SARS-CoV-2 inngangsfaktorer, angiotensinkonverterende enzym 2 (ACE2) og transmembran serinprotease 2 (TMPRSS2). De fungerer også som et reservoar for SARS-CoV-2.

Interessant nok er 80 % av SARS-CoV-2-infeksjoner asymptomatiske. I tillegg har studier rapportert at SARS-CoV-2 retter seg mot menneskelige spyttkjertler og smittsomme virioner fra spyttet til asymptomatiske individer bidrar til ytterligere virusoverføring.

På grunn av evnen til SARS-CoV-2 til å infisere flere typer organoider, kan en organoid kulturmodell vise seg egnet til å oppdage infeksjon med SARS-CoV-2 i spyttkjertler (in vitro). På grunn av mangelen på egnede in vitro-modeller har imidlertid studier ikke klart å belyse mekanismene som ligger til grunn for infeksjonen og replikasjonen av SARS-CoV-2 i spyttkjertlene og påfølgende sekresjon til spytt.

Om studiet

I denne studien genererte forskere funksjonelle spyttkjertelorganoider fra menneskelige induserte pluripotente stamceller (hiPSCs) med lignende morfologiske egenskaper og fysiologiske funksjoner (in vivo) som menneskelige spyttkjertler. Videre hadde disse organoidene spyttkjertelspesifikke cellelinjer.

Teamet utførte encellet ribonukleinsyresekvensering (scRNA-seq) av hiSG-celler på dag 80 ved å bruke 10X Genomics-plattformen. I tillegg isolerte de organoidene på dag 60 og dyrket dem med fibroblastvekstfaktor (FGF) 7 og 10 til dag 80 for å karakterisere forgreningsstrukturene som ble observert.

SRY-boks transkripsjonsfaktor 9 (SOX9) genet regulerer spyttkjertelutvikling hos mus og mennesker. I fravær kan spyttkjertlene ikke gjennomgå forgrenende morfogenese. Derfor undertrykte forskerne SOX9 under hiSG-induksjon for å finne ut om hiSGs rekapitulerte den SOX9-medierte utviklingsprosessen.

Studieresultater

De menneske-induserte spyttkjertlene (hiSGs) hadde lignende egenskaper som embryonale spyttkjertler, inkludert morfologiske egenskaper, proteinmarkøruttrykk og genuttrykksegenskaper. I samsvar med in vivo-studier utført på mus, hemmet SOX9 knockdown grendannelse i hiPSCs, noe som antyder at dette genet er kritisk for utvikling av menneskelig spyttkjertel. Dermed kan denne studiemodellen erstatte dyremodeller som brukes til å studere menneskelig spyttkjertelutvikling.

HiSG-ene etterlignet morfologisk og funksjonelt naturlige spyttkjertler. Upartisk scRNA-seq-klynger identifiserte seks hovedcellegrupper som er videre delbare i cellulære undertyper. Den lille mesenkymale populasjonen i HiSG-ene viste ikke trekk ved spyttkjertelmesenkym. Derimot besto epitelcellegruppen av fem cellegrupper: acinære, basale, ductale, myoepiteliale og aktivt syklingceller. HiSG-ene omfattet uavhengige avstamninger av basale myoepitelceller fra den duktale-acinære avstamningen, og pseudotidsanalyse demonstrerte forskjellene mellom disse to cellelinjene.

Spyttkjertlenes grunnleggende funksjon er å skille ut acetylkolinindusert væske via muskarine acetylkolinreseptorveier. I hiSGs resulterte behandling med karbakol, en muskarin acetylkolinreseptoragonist, i en forbigående og doseavhengig økning i intracellulære kalsiumnivåer. Videre viste ortotopisk transplanterte hiSG-er fenotypen til modne spyttkjertler transplantert til et mottakersted hos mus over tid.

ScRNA-seq og immunfluorescensanalysene viste også at de ductale cellene i hiSGs rikelig uttrykte ACE2 og TMPRSS2, lik normale spyttkjertler. Immunfargingsmetoden viste at selv om duktale celler på den apikale siden av hiSGs sterkt uttrykte ACE2, uttrykte duktale celler og acinære celler TMPRSS2. Ved kontakt med SARS-CoV-2 ble hiSGs infisert og viste SARS-CoV-2-replikasjon innen 24 timer etter infeksjon. Forfatterne oppdaget også SARS-CoV-2-nukleoproteinet i infiserte ductale celler. Følgelig viste den medium infeksiøse vevskulturanalysen (TCID50) infeksiøse virus i hiSGs som nådde en topp etter 24 timer, men avtok senere.

Konklusjoner

Faktisk kan hiSGs utviklet i denne studien tjene som en verdifull modell for reproduksjon av heterogene cellepopulasjoner i menneskelige spyttkjertler. Videre kan hiSGs støtte den funksjonelle analysen av gener under utvikling og tjene som et lovende verktøy for å studere SARS-CoV-2-infeksjoner i spyttkjertler på molekylært nivå. I tillegg viste forskerne at hiSGs hadde flere fordeler sammenlignet med organoider avledet fra stamceller fra vev fra voksne spyttkjertler. For eksempel kan de enkelt genetisk modifiseres ved å bruke genredigeringsverktøyet CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) og CRISPR-assosiert protein 9 (Cas9) og var relativt enkle å dyrke.

Referanse:

• Tanaka, J., Senpuku, H., Ogawa, M. et al. Vom Menschen induzierte pluripotente, aus Stammzellen gewonnene Speicheldrüsenorganoide modellieren die SARS-CoV-2-Infektion und -Replikation. Nat Cell Biol (2022). https://doi.org/10.1038/s41556-022-01007-6, https://www.nature.com/articles/s41556-022-01007-6#Sec7