Cientistas estão desenvolvendo organoides de glândulas salivares humanas para testar a infectividade do SARS-CoV-2

Cientistas estão desenvolvendo organoides de glândulas salivares humanas para testar a infectividade do SARS-CoV-2

Em um estudo publicado recentemente na revista Biologia celular natural Os pesquisadores demonstraram in vitro a suscetibilidade das glândulas salivares à infecção por síndrome respiratória aguda grave por coronavírus-2 (SARS-CoV-2) usando um modelo de cultura organoide.

Estudar: Modelo de organoides de glândulas salivares derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, infecção e replicação por SARS-CoV-2. Crédito da foto: NIAID

fundo

Embora o sistema respiratório, incluindo o trato respiratório superior (TRS) e os pulmões, sejam os principais alvos do SARS-CoV-2, há evidências crescentes de que afeta múltiplos órgãos. Por exemplo, a mucosa oral e as glândulas salivares expressam amplamente dois fatores de entrada do SARS-CoV-2, a enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) e a serina protease 2 transmembrana (TMPRSS2). Eles também servem como reservatório para o SARS-CoV-2.

Curiosamente, 80% das infecções por SARS-CoV-2 são assintomáticas. Além disso, estudos relataram que o SARS-CoV-2 tem como alvo as glândulas salivares humanas e os vírions infecciosos da saliva de indivíduos assintomáticos contribuem para uma maior transmissão do vírus.

Devido à capacidade do SARS-CoV-2 de infectar vários tipos de organoides, um modelo de cultura organoide pode ser adequado para detectar infecção por SARS-CoV-2 em glândulas salivares (in vitro). No entanto, devido à falta de modelos in vitro adequados, os estudos não conseguiram elucidar os mecanismos subjacentes à infecção e replicação do SARS-CoV-2 nas glândulas salivares e subsequente secreção na saliva.

Sobre o estudo

No presente estudo, os pesquisadores geraram organoides funcionais das glândulas salivares a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) com características morfológicas e funções fisiológicas semelhantes (in vivo) às glândulas salivares humanas. Além disso, esses organoides tinham linhas celulares específicas das glândulas salivares.

A equipe realizou o sequenciamento de ácido ribonucleico unicelular (scRNA-seq) de células hiSG no dia 80 usando a plataforma 10X Genomics. Além disso, isolaram os organoides no dia 60 e os cultivaram com fator de crescimento de fibroblastos (FGF) 7 e 10 até o dia 80 para caracterizar as estruturas ramificadas observadas.

O gene do fator de transcrição 9 da caixa SRY (SOX9) regula o desenvolvimento das glândulas salivares em camundongos e humanos. Na sua ausência, as glândulas salivares não podem sofrer morfogênese ramificada. Portanto, os pesquisadores suprimiram o SOX9 durante a indução do hiSG para descobrir se os hiSGs recapitularam o processo de desenvolvimento mediado pelo SOX9.

Resultados do estudo

As glândulas salivares induzidas por humanos (hiSGs) tinham propriedades semelhantes às glândulas salivares embrionárias, incluindo características morfológicas, expressão de marcadores proteicos e características de expressão gênica. Consistente com estudos in vivo conduzidos em camundongos, o knockdown de SOX9 inibiu a formação de ramos em hiPSCs, sugerindo que este gene é crítico para o desenvolvimento da glândula salivar humana. Assim, este modelo de estudo poderia substituir os modelos animais utilizados para estudar o desenvolvimento das glândulas salivares humanas.

Os hiSGs imitaram morfológica e funcionalmente as glândulas salivares naturais. O agrupamento imparcial de scRNA-seq identificou seis grupos celulares principais que são ainda divisíveis em subtipos celulares. A pequena população mesenquimal nos HiSGs não apresentou características do mesênquima das glândulas salivares. Em contraste, o grupo de células epiteliais consistia em cinco grupos de células: células acinares, basais, ductais, mioepiteliais e de ciclo ativo. Os hiSGs compreendiam linhagens independentes de células mioepiteliais basais da linhagem ductal-acinar, e a análise de pseudotempo demonstrou as diferenças entre essas duas linhagens celulares.

A função básica das glândulas salivares é secretar fluido induzido por acetilcolina através das vias dos receptores muscarínicos de acetilcolina. Nos hiSGs, o tratamento com carbacol, um agonista do receptor muscarínico de acetilcolina, resultou num aumento transitório e dependente da dose nos níveis de cálcio intracelular. Além disso, os hiSGs transplantados ortotopicamente exibiram o fenótipo de glândulas salivares maduras transplantadas para um local receptor em camundongos ao longo do tempo.

As análises de scRNA-seq e imunofluorescência também mostraram que as células ductais dentro dos hiSGs expressavam abundantemente ACE2 e TMPRSS2, semelhantes às glândulas salivares normais. O método de imunocoloração revelou que embora as células ductais no lado apical dos hiSGs expressassem fortemente ACE2, as células ductais e as células acinares expressavam TMPRSS2. Após o contato com o SARS-CoV-2, os hiSGs foram infectados e mostraram replicação do SARS-CoV-2 dentro de 24 horas após a infecção. Os autores também descobriram a nucleoproteína SARS-CoV-2 em células ductais infectadas. Consequentemente, o ensaio de cultura de tecidos infecciosos médios (TCID50) mostrou vírus infecciosos em hiSGs que atingiram o pico às 24 horas, mas diminuíram posteriormente.

Conclusões

Na verdade, os hiSGs desenvolvidos no presente estudo poderiam servir como um modelo valioso para a reprodução de populações celulares heterogêneas nas glândulas salivares humanas. Além disso, os hiSGs poderiam apoiar a análise funcional de genes durante o desenvolvimento e servir como uma ferramenta promissora para estudar infecções por SARS-CoV-2 em glândulas salivares a nível molecular. Além disso, os pesquisadores mostraram que os hiSGs tinham várias vantagens em comparação com os organoides derivados de células progenitoras-tronco teciduais de glândulas salivares humanas adultas. Por exemplo, eles poderiam ser facilmente modificados geneticamente usando a ferramenta de edição genética CRISPR (repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas) e a proteína 9 associada ao CRISPR (Cas9) e eram relativamente fáceis de cultivar.

Referência:

• Tanaka, J., Senpuku, H., Ogawa, M. et al. Vom Menschen induzierte pluripotente, aus Stammzellen gewonnene Speicheldrüsenorganoide modellieren die SARS-CoV-2-Infektion und -Replikation. Nat Cell Biol (2022). https://doi.org/10.1038/s41556-022-01007-6, https://www.nature.com/articles/s41556-022-01007-6#Sec7