Forskare utvecklar mänskliga spottkörtelorganoider för att testa smittsamheten hos SARS-CoV-2

Forskare utvecklar mänskliga spottkörtelorganoider för att testa smittsamheten hos SARS-CoV-2

I en studie som nyligen publicerats i tidskriften Naturlig cellbiologi Forskare visade in vitro känsligheten hos spottkörtlar för allvarlig akut respiratoriskt syndrom coronavirus-2 (SARS-CoV-2)-infektion med hjälp av en organoid odlingsmodell.

Studera: Människan-inducerad pluripotent stamcellshärledd spottkörtelorganoider modell SARS-CoV-2-infektion och replikering. Fotokredit: NIAID

bakgrund

Även om andningsorganen, inklusive de övre luftvägarna (URT) och lungorna, är huvudmålen för SARS-CoV-2, finns det allt fler bevis för att det påverkar flera organ. Till exempel uttrycker munslemhinnan och spottkörtlarna i stor utsträckning två SARS-CoV-2-inträdesfaktorer, angiotensinomvandlande enzym 2 (ACE2) och transmembran serinproteas 2 (TMPRSS2). De fungerar också som en reservoar för SARS-CoV-2.

Intressant nog är 80 % av SARS-CoV-2-infektioner asymtomatiska. Dessutom har studier rapporterat att SARS-CoV-2 riktar sig mot mänskliga spottkörtlar och infektiösa virioner från saliven från asymtomatiska individer bidrar till ytterligare virusöverföring.

På grund av SARS-CoV-2s förmåga att infektera flera typer av organoider kan en organoidodlingsmodell visa sig lämplig för att upptäcka infektion med SARS-CoV-2 i spottkörtlar (in vitro). Men på grund av bristen på lämpliga in vitro-modeller har studier misslyckats med att belysa mekanismerna bakom infektionen och replikeringen av SARS-CoV-2 i spottkörtlarna och efterföljande utsöndring i saliv.

Om studien

I den aktuella studien genererade forskare funktionella spottkörtelorganoider från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) med liknande morfologiska egenskaper och fysiologiska funktioner (in vivo) som mänskliga spottkörtlar. Dessutom hade dessa organoider spottkörtelspecifika cellinjer.

Teamet utförde encellig ribonukleinsyrasekvensering (scRNA-seq) av hiSG-celler på dag 80 med hjälp av 10X Genomics-plattformen. Dessutom isolerade de organoiderna på dag 60 och odlade dem med fibroblasttillväxtfaktor (FGF) 7 och 10 till dag 80 för att karakterisera de observerade förgreningsstrukturerna.

SRY-box-transkriptionsfaktor 9-genen (SOX9) reglerar spottkörtelutvecklingen hos möss och människor. I sin frånvaro kan spottkörtlarna inte genomgå förgrenad morfogenes. Därför undertryckte forskarna SOX9 under hiSG-induktion för att ta reda på om hiSGs rekapitulerade den SOX9-medierade utvecklingsprocessen.

Studieresultat

De mänskligt inducerade spottkörtlarna (hiSGs) hade liknande egenskaper som embryonala spottkörtlar, inklusive morfologiska egenskaper, proteinmarköruttryck och genuttrycksegenskaper. I överensstämmelse med in vivo-studier utförda på möss, hämmade SOX9 knockdown grenbildning i hiPSCs, vilket tyder på att denna gen är avgörande för utvecklingen av mänsklig spottkörtel. Således kan denna studiemodell ersätta djurmodeller som används för att studera mänsklig spottkörtelutveckling.

HiSGs efterliknade morfologiskt och funktionellt naturliga spottkörtlar. Opartisk scRNA-seq-klustring identifierade sex huvudcellgrupper som är ytterligare delbara i cellulära subtyper. Den lilla mesenkymala populationen i HiSGs visade inte drag av spottkörtelmesenkym. Däremot bestod epitelcellgruppen av fem cellgrupper: acinära, basala, ductala, myoepitelceller och aktivt cyklande celler. HiSGs bestod av oberoende linjer av basala myoepitelceller från den duktala-acinära linjen, och pseudotidsanalys visade skillnaderna mellan dessa två cellinjer.

Spottkörtlarnas grundläggande funktion är att utsöndra acetylkolin-inducerad vätska via muskarina acetylkolinreceptorvägar. I hiSGs resulterade behandling med karbakol, en muskarin acetylkolinreceptoragonist, i en övergående och dosberoende ökning av intracellulära kalciumnivåer. Dessutom uppvisade ortotopiskt transplanterade hiSGs fenotypen av mogna spottkörtlar transplanterade till ett mottagarställe i möss över tid.

ScRNA-seq och immunofluorescensanalyser visade också att de ductala cellerna i hiSGs uttryckte rikligt ACE2 och TMPRSS2, liknande normala spottkörtlar. Immunfärgningsmetoden avslöjade att även om ductala celler på den apikala sidan av hiSGs starkt uttryckte ACE2, uttryckte ductala celler och acinära celler TMPRSS2. Vid kontakt med SARS-CoV-2 blev hiSGs infekterade och visade SARS-CoV-2-replikation inom 24 timmar efter infektion. Författarna upptäckte också nukleoproteinet SARS-CoV-2 i infekterade ductala celler. Följaktligen visade den medium infektiösa vävnadskulturanalysen (TCID50) infektiösa virus i hiSGs som nådde en topp efter 24 timmar men minskade senare.

Slutsatser

Faktum är att de hiSGs som utvecklats i den aktuella studien kan fungera som en värdefull modell för reproduktion av heterogena cellpopulationer i mänskliga spottkörtlar. Dessutom kan hiSGs stödja den funktionella analysen av gener under utveckling och fungera som ett lovande verktyg för att studera SARS-CoV-2-infektioner i spottkörtlar på molekylär nivå. Dessutom visade forskarna att hiSGs hade flera fördelar jämfört med organoider som härrör från vävnadsstamceller från vuxna mänskliga spottkörtlar. Till exempel kunde de enkelt genetiskt modifieras med hjälp av genredigeringsverktyget CRISPR (klustrade med regelbundna korta palindromiska upprepningar) och CRISPR-associerat protein 9 (Cas9) och var relativt lätta att odla.

Hänvisning:

• Tanaka, J., Senpuku, H., Ogawa, M. et al. Vom Menschen induzierte pluripotente, aus Stammzellen gewonnene Speicheldrüsenorganoide modellieren die SARS-CoV-2-Infektion und -Replikation. Nat Cell Biol (2022). https://doi.org/10.1038/s41556-022-01007-6, https://www.nature.com/articles/s41556-022-01007-6#Sec7